Биотехнологические методы получения иммуноглобулинов и применение их в научных исследованиях и медицине. IgG. - презентация

1 Биотехнологические методы получения иммуноглобулинов и применение их в научных исследованиях и медицине. IgG

2 Гибридомная технология. Методика получения лимфоидных гибридом, позволяющая получать моноклональные антитела практически на любой антиген в необходимых количествах. Технология лимфоидных гибридом была разработана в 1975 году Мильштейном и Келлером 1984 году Келлер и Мильштейн были удостоены Нобелевской премии.

3 Гибридомная технология строилась на основе следующих разработок: 1) имелись линии миеломных клеток мышей balb/c (дефектные по некоторым ферментам метаболизма нуклеиновых кислот) 2) Линии этих раковых клеток-носителей, имели дефект гена кодирующий одтн из ферментов (тимидинкиназе (ТК) или гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазе (ГГФРТ)) 3) Технология слияния клеток с помощью вирусов (вирус Сендай) и полиэтиленгликоля Гибридомная технология.

4

5

6 Collect RNA Convert RNA to DNA PCR amplify antibody genes Heavy Chain Genes Light Chain genes Натуральные библиотеки антител - наивные библиотеки (naïve library) - иммунные библиотеки (immune library) Конструирование комбинаторной библиотеки Фаговый дисплей.

7 Фаговый дисплейФаговый дисплей E.coli TG1 pHEN2 Ori M13 AprApr P lacZ RBS ColE1 pIII Vh Vl His Линкер Ser(Gly 4 Ser) 2 AlaArgGlySerGly 4 Ser Конструирование комбинаторных библиотек

8 Фаговый дисплей. Фаг M13

9 Фаговый дисплей Получение индивидуальных одноцепочечных антител Vh Vl pIII TAG Vh Vl Несупрессорные штаммы E.coli: TAG Gln Одноцепочечное антитело ковалентно связано с белком рIII фаговой частицы amber Vh Vl pIII VhVl аминокислотастоп-кодон C-myc 6×His C-myc 6×His

10 Фаговый дисплей Фагмида Фаг-помощник Геном фага Инфицирование E.coli фагом-помощником

11 Фаговый дисплей Следующий раунд Элюция V V V V V Аффинная селекция (биопеннинг) Амплификация в E.coli антиген

12 Фаговый дисплей. Ренатурирование in vitro Функциональное scFv Агрегировавшие АТ Частичный лизис внешней мембраны Функциональное scFv Плазмида Цит. тельце включения Секреция Продукция антиген-связывающих фрагментов антител в E.coli