G.Filipenko@vir.nw.ru Методы ex situ сохранения генетических ресурсов растений. - презентация

1 Методы ex situ сохранения генетических ресурсов растений

2 Конвенция о биологическом разнообразии – первое глобальное соглашение по сохранению и устойчивому использованию биологического разнообразия Конвенция вступила в силу 29 декабря 1993 года, через восемнадцать месяцев после того, как на Конференции ООН по окружающей среде и развитию, прошедшей в 1992 году в Рио-де-Жанейро, она была открыта для подписания. Более 150 правительств подписали этот документ сразу после вступления его в силу, а к настоящему моменту Конвенция ратифицирована 188 странами. Россия подписала Конвенцию в 1995 г.

3 Сохранение биологического разнообразия «Сохранение ex-situ» означает сохранение компонентов биологического разнообразия вне их естественных мест обитания. «Сохранение in-situ» означает сохранение экосистем и естественных мест обитания, а также поддержание и восстановление жизнеспособных популяций видов в их естественной среде, а применительно к одомашненным или культивируемым видам - в той среде, в которой они приобрели свои отличительные признаки.

4 Ex situ: плюсы и минусы Сосредоточенность растительного разнообразия как исходного материала в одном месте, в искусственно контролируемых условиях. Относительная безопасность и гарантия сохранения. Возможность последовательного и целенаправленного изучения, а также – ускоренного использования в селекции. Оперативная доступность для пользователя. Централизованное управление, возможность обработки данных, создание единой БД. Возможность постоянного учета и контроля за продвижением материала. Cохраняются лишь отдельные фрагменты популяций: отдельные растения, семена, ДНК, пыльца или вегетативные части растений. Состав коллекции постепенно обедняется в связи с постоянным пересевом и механическими потерями. Содержание коллекций и их поддержание в живом виде связано с большими финансовыми затратами. Наличие штата научных сотрудников и технического персонала для работы с коллекцией и необходимость их профессиональной подготовки

5 Ex situ хранение генетических ресурсов растений Контролируемыеусловия Неконтролируемые условия Низкотемпературное хранение семян (+4°С; –10°С ; –18°С ) Криоконсервация вегетативно размножаемых культур In vitro коллекции вегетативно размножаемых культур Полевые коллекции Хранение семян в лабораторных условиях Ультрасухие семена

6 Организация генетических банков растений США г. Япония г. СССР г. Турция – 1978 г. Скандинавские страны г.

7 5 основных генбанков мира (FAO, 2009) 1750 генбанков мира сохраняют 7,03 млн. образцов (FAO, 2009)

8 Мировые ex situ коллекции 10 экономически значимых культур (FAO, 2009) КУЛЬТУРЫЧИСЛО ОБРАЗЦОВ 1. Пшеница Рис Кукуруза Фасоль (бобы) Сорго Соя Овес Арахис Картофель Горох93977

9 КОЛЛЕКЦИИ СТРАН СНГ СтранаЧисло образцов РОССИЯ (ВИР) (54,1%) УКРАИНА (21,7%) УЗБЕКИСТАН (9,2%) КАЗАХСТАН (5,8%) БЕЛАРУСЬ (5,3%) ГРУЗИЯ7 000 (1,1%) АРМЕНИЯ5 000 (0,9%) МОЛДОВА5 000 (0,9%) КИРГИЗИЯ3 000 (0,5%) ТАДЖИКИСТАН3 000 (0,5%) ВСЕГО

10 Svalbard Global Seed Vault Отправка образцов коллекции ВИР в хранилище на Шпицбергене в гг. 10 марта 2010 года число образцов, поступивших из 27 генбанков, превысило Бобы260Рапс100 Вигна30Рожь93 Горох48 Мягкая яровая пшеница 847 Кукуруза989Твердая пшеница51 Маш150Фасоль81 Люпин24 Чечевица обыкновенная 139 Нут71Чина9 Овес210Ячмень803 Сорго257 Всего4162

11 На дне высохшего озера в Маньчжурии были найдены семена индийского лотоса, пролежавшие там, как предполагалось сначала, 160 лет (Ohga I., 1926) Позже при помощи метода определения распада радиоактивного углерода было показано, что возраст этих семян 1040±210 лет (Libby W.F., 1951) В1954 году в северо-западной части Канады при археологических раскопках на плато Юкон в толще промерзшего ила были обнаружены семена люпина арктического. Ученые определили, что им лет. Семена прорастили в 1966 году, шесть проросли, дали всходы, и из них выросли здоровые растения (Porsild A.E., Harington C.R., 1967) Nelumbo nucifera Gaerth.

12 В гг. при исследовании лессово-ледовых отложений приморских низменностей севера Якутии, относимых к эпохе позднего плейстоцена, неоднократно встречались погребенные норы грызунов, содержащие плоды и семена растений. Их численность в отдельных норах достигала тысяч штук. Вид растенийВозраст семян Полученный результат Сем. Осоковых32800±400Разрастание семядоли у единичного семени Смолевка32800±400Индукция начальной стадии прорастания зародышевого корешка и каллусообразование на основе полученных клеток корня Костянка27700±300Активация роста зародышевого корешка Горец31800±300Развитие до стадии образования семядольных листьев у единичного семени Использование метода культуры тканей для анализа жизнеспособности семян из нор грызунов, погребенных в вечномерзлотных толщах

13 П. Беккерель исследовал жизнеспособность семян, полученных им из хранилищ парижского Национального музея. Семена были собраны в период с 1819 г. по 1853 г., а способность их к прорастанию изучалась в 1906 г. и затем в 1934 г. Astragalus massiliensis Lam. Для 13 видов П.Беккерель установил длительность жизни, равную г.г., а для ряда видов семейства бобовых - около 200 лет (Becquerel P., 1932, 1934) Cassia bicapsularis L.

14 Классификация семян по долголетию М и кробиотики ( меньше 3 лет) Мезобиотики (3-15 лет) М а кробиотики ( больше 15 лет) Ewart A.J. On the longevity of seeds. Proc. Roy. Soc, Victoria , Ewart, Alfred J. ( )

15 Макробиотики Бобы Вика Вигна Горох Лен Нут Мягкая пшеница Овес Просо Свекла Твердая пшеница Хлопок Чечевица Эгилопс Ячмень Мезобиотики Горчица Кукуруза Кунжут Подсолнечник Рожь Редкие виды пшениц Тритикале Фасоль Микробиотики Гречиха Кабачки Лук Рис Соя

16 Примеры долголетия семян в опытах лаборатории семеноведения ВИР КультураСрок храненияВсхожесть Гречиха3940 Соя4024 Кукуруза5495 Бобы4299 Лен3799 Просо4095 Пшеница6522 Ячмень5478

17 Условия хранения, влияющие на долголетие семян Температура Влажность Парциальное давление кислорода

18 Снижение температуры на каждые 5° увеличивает продолжительность жизни семян примерно в два раза. Это правило верно в пределах 0 до 50 °С (Леман Е., Айхеле Ф., 1936, HurringtonJ,F., 1963) Температуры ниже нуля благоприятно сказываются на сохранении жизнеспособности семенами, если их влажность не настолько велика, чтобы в них произошло повреждение клеток и тканей от промерзания (Von Sengbush, 1955)

19 Увеличение влажности на 1% в интервале от 5 до 15% укорачивает вдвое период их жизнеспособности (Hurrington J.F., 1963) Величины критической влажности зерна и семян различных культур (%): гороха, фасоли, чечевицы пшеницы, ржи, ячменя - 14,5...15,5 кукурузы, пpoca, сорго, столовой свеклы - 12, томатов – 11,5…12,5 подсолнечника (среднемасличного), моркови огурцов - 9,5...10,5 капусты – 9…10 подсолнечника (высокомасличного) – 0…8

20 Рекальцитрантные семена содержат большое количество влаги, их нельзя высушивать при хранении ниже определенного уровня, который у них довольно высок. К рекальцитрантным относят семена древесных, тропических, цитрусовых и некоторых других видов растений. Ортодоксальные семена можно высушивать до низкого уровня влажности -5% и даже ниже. К ним относятся семена подавляющего большинства культурных видов растений (Hong T.D., Ellis R.H.,1996)

21 Влияние длительного хранения семян пшеницы сорта Диамант на их всхожесть Число лет хранения Всхожесть,%

22 Хранение семян в условиях контролируемой температуры и влажности показало, что увеличение парциального давления кислорода с 0 до 21% ведет к снижению всхожести. Дальнейшее его увеличение практически никакого действия не оказывает ( Abdalla F.H., Roberts E.H., 1968) В долговременных опытах по хранению лука и салата было показано, что семена лучше сохраняют жизнеспособность в ампулах с углекислым газом, чем с кислородом (Harrington B.J., 1966)

23 Другие факторы, влияющие на жизнеспособность семян при хранении Всхожесть Наследственные факторы Матрикальная разнокачественность Фазы спелости Место выращивания Болезни и вредители Фумигация Механические повреждения

24 Генетические изменения в семенах при длительном хранении Cемена Oenotera lamarkiana L. хранившиеся в течение пяти лет, дали значительно больше фенотипических вариантов, чем семена, хранившиеся в течение одного года (DeVries, 1901). Аналогичные результаты получил в 1931 году Н.Г.Нильссон, работавший с тем же видом (Nilsson N.H., 1931).

25 В 1933 году М.С.Навашин, исследовавший семена скерды (Сrepis tectorum L.), обнаружил, что только 0,1% проростков свежих семян имели в корнях клетки с хромосомными транслокациями, в то время как после 7 лет хранения число таких растений возросло до 81%. Ф.Х.Пето, изучавший семена кукурузы (Zea mays L.), также наблюдал возрастание частоты хромосомных аберраций в кончиках корней проростков длительно хранившихся семян (Peto F.H., 1933)

26 В настоящее время в генетических банках растений коллекции принято подразделять на три типа Базовые Активные Дублетные

27 Как правило, семена из базовых коллекций не предоставляют непосредственно пользователям. Материал из них берут только для восстановления образца, когда жизнеспособность семян снижается ниже допустимого уровня, или когда образец не может быть получен ни из какого другого источника. Базовая коллекция – золотой фонд генетического банка растений. Активные коллекции содержат образцы, которые служат для восстановления, размножения, рассылки, изучения и т.д. Дублетные коллекции представляют собой дублетные образцы базовой коллекции, которые хранят отдельно от нее, чтобы увеличить надежность хранения.

28 Термины базовая или активная коллекция не являются синонимами условий хранения образцов. Однако обычно базовые коллекции хранят в условиях, обеспечивающих их длительное хранение (long – term conservation). Активные коллекции хранят в более мягких условиях, что связано, в основном, с экономическими причинами и, отчасти, с удобством пользования. Такие условия обеспечивают среднесрочное хранение коллекций (medium – term conservation)- обычно не менее лет.

29 Условия хранения базовых коллекций Допустимо: Температура ниже 0 (

30 Состав коллекции ВИР 64 ботанических семейства, 376 родов, 2169 видов Отдел ГРР Число образцов Пшениц51662 Овса, ржи и ячменя36509 Крупяных культур48358 Масличных и прядильных культур Многолетних кормовых культур30489 Зерновых бобовых культур45845 Овощных и бахчевых культур50138 Плодовых культур23734 Картофеля9647 Всего323853

31 С целью сохранения базовой коллекции в 1976 году на Кубанской опытной станции ВИР было построено Национальное хранилище семян. Оно представляет собой трехэтажное здание, в котором два этажа находятся под землей. На этих этажах расположены 24 камеры для хранения семян.

32 Каждая камера может вмещать тысяч образцов в зависимости от размера контейнеров.

33 Количество образцов коллекции ВИР, сохраняемых при разных температурных режимах в «Кубанском генетическом банке семян» Тип коллекцииТемпература, °С Количество образцов Базовая 4, Дублетная4, Активная4, Итого

34 Снижение всхожести образцов коллекции ВИР в процессе длительного хранения в «Кубанском генетическом банке семян» Группа культурКоличество образцов, шт.Доля образцов, нуждающихся в пересеве, % заложенотребует пересева Зерновые и крупяные ,5 Просовидные ,0 Зернобобовые ,4 Овощные и бахчевые ,5 Масличные и технические ,7 Кормовые ,6 Итого ,0 Данные по проращиванию образцов семян в г.г. Образцы были заложены на хранение в г.г.

35 В 2000 г. в Санкт-Петербурге в зданиях ВИР были введены в строй новые низкотемпературные хранилища

36 Основные сведения о новых низкотемпературных хранилищах ВИР Тип коллекции Характеристика хранящихся образцов Объем, м³ Темпера- тура, º С Число контей- неров 1базоваявсе активнаяМикробиотики, перекрестно- опыляемые, редкие, трудные в размножении активная активнаяМакробиотики, мезобиотики 218, активная218,541488

37 International Rules for Seed Testing, 2010 ISTA Working Sheets on Tetrasolium Testing, 2003 ГОСТ Методы определения всхожести ГОСТ Методы определения влажности. Лаборатория длительного хранения семян является членом ISTA

38 Подсушивание семян перед закладкой на хранение в сушильной камере при 20°C и 12%-й относительной влажности воздуха до 3-7%-й влажности семян (в зависимости от вида) Упаковка: фольговые ламинированные пакеты и стеклянные бутылочки

39 Примеры динамики подсушивания семян в сушилках ВИР

40 Низкотемпературное хранение образцов семян мировой коллекции ВИР в центре (на г.) Отдел ГРРБазовая коллекция -10° С Активная коллекция -10° С4° С Пшениц Овса, ржи, ячменя Крупяных культур Зерновых бобовых Овощных и бахчевых Масличных и прядильных культур Многолетних кормовых культур Картофеля Плодовых культур ЛДХГР Всего В общей сложности на хранении находятся образца

41 В 2004 г. в ВИР введен в строй криокомплекс

42 РАСТИТЕЛЬНЫЕ ОБЪЕКТЫ Семена Пыльца Вегетативные почки Культура тканей и органов in vitro МЕТОДЫ КРИОСОХРАНЕНИЯ Ступенчатое замораживание Неконтролируемое замораживание Витрификация Инкапсуляция Неконтролируемое замораживание АКТУАЛЬНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ Актуально для семян редких видов Нет другой альтернативы КРИОХРАНЕНИЕ – ПЕРЕДОВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ХРАНЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ РЕСУРСОВ

43 Криоконсервация плодовых растений в ВИР Отработаны методики криоконсервации почек яблони (P.Forsline,1998) пыльцы большинства плодовых и ягодных культур семян диких видов яблони, груши, вишни, красной и черной смородины, крыжовника, малины, ежевики Идет разработка и модификация методик криоконсервации черенков и почек груши, жимолости синей, крыжовника, смородины черной, черемухи Идет закладка на длительное хранение в парах жидкого азота Почек и черенков яблони, груши, крыжовника, черемухи, черной смородины пыльцы большинства плодовых и ягодных культур семян диких видов яблони, груши, вишни, красной и чернойсмородины, крыжовника, малины, ежевики

44 Криоконсервация пыльцы плодовых культур Пыльцу, подсушенную в комнатных условиях в течение 2-3дней, закладывают в азот прямым погружением. Жизнеспособность определяют посевом на питательную среду (сахароза 10-20% + 0,5% агар-агар), с последующим подсчетом проросших пыльцевых зерен под микроскопом в 3-хкратной повторности. Влияние криоконсервации на жизнеспособность пыльцы яблони СортЖизнеспособность, % исходнаяпосле хранения при-196 º С Ароматное48,0 ± 1,039,1 ± 0,7 Боровинка56,0 ± 1,348,4 ± 3,2 Вкусная40,7 ± 2,659,9 ± 3,3 Июньское Петрова 20,7 ±1,817,6 ± 1,9 Ранетка консервная 41,7 ± 1,336,6 ± 1,7 Процент завязывания ягод сортов черной смородины Risager, Белоплодная и Лазурь при опылении пыльцой, хранившейся при 186°С, составил 94,3-100%.

45 Подсушивание семян до влажности 5-6 %, быстрое замораживание путем прямого погружения пробирок с семенами в жидкий азот и оттаивание их при комнатной температуре. Методика криоконсервации семян диких видов яблони, груши, красной смородины и крыжовника Определение жизнеспособности семян плодовых культур тетразольно-топографическим методом Влияние криоконсервации семян яблони на их жизнеспособность исходнаяпосле криоконсервации Динамика прорастания семян яблони после низкотемпературного и криохранения Суммарная доля проклюнувшихсясемян, % M. baccata M. purperea M. cerasifera криохранение (-196°С) низкотемпературное хранение (-18°С)

46 Криоконсервация спящих почек яблони Образцы нарезают на однопочковые сегменты длиной до 35 мм и подсушивают в холодильнике при - 5 °C до влажности 28-32%. Замораживание до -30°C проводят в программном замораживателе, понижая температуру со скоростью 1°C/час, затем погружают образцы в жидкий азот. Вынутые из жидкого азота образцы выдерживают в течение суток в холодильнике при температуре 4° C в эксикаторах над парами воды для гидратации. Для проверки жизнеспособности обычно используется метод окулировки почек

47 Метод контроля аутентичности образцов черемухи в процессе хранения при сверхнизких температурах, основанный на использовании молекулярного маркирования Опыт Контроль ISSR 812 Контроль Опыт ISSR М10 ISSR-анализ ДНК образцов черемухи, выделенной из почек до (контроль) и после (опыт) сохранения при сверхнизкой температуре. Сорта: 1- Ранняя круглая, 2- Ольгина радость, 3- Августина, 4- Гранатовая гроздь, 5- Сахалинская устойчивая В ходе работы было протестировано восемь ISSR-праймеров, два из которых показали наиболее полиморфную картину ПЦР, позволяющую выявить генетические различия между анализируемыми сортами. Метод ISSR-профилирования ДНК позволяет установить степень целостности ДНК почек черемухи, а также подтвердить аутентичность генетического материала, сохраняемого при сверхнизких температурах в условиях генбанка.

48 Хранение образцов плодовых культур и картофеля в парах жидкого азота (на г.) КультураЧисло сохраняемых образцов, шт. пыльцачеренки Груша7021 Жимолость синяя 4 Земляника26- Картофель11- Крыжовник410 Малина50- Слива81- Смородина черная 2515 Черемуха-5 Черешня17- Яблоня16063 Всего464114

49

50