Рекомбинантты ДНҚ құрылысы. Рекомбинантты ДНҚ технологиясын (РДТ) in vitro жағдайьшда әртүрлі ДНК молекулаларын, бөтен гендерін біріктіру технологиясын. - презентация

1 Рекомбинантты ДНҚ құрылысы

2 Рекомбинантты ДНҚ технологиясын (РДТ) in vitro жағдайьшда әртүрлі ДНК молекулаларын, бөтен гендерін біріктіру технологиясын іске асырып, кейін реципиент организмде олардың репликациясын жүргізіп инженерия аясындағы жетістік деп сипаттауға болады. Рекомбинантты ДНҚ технологиясының тірі клеткада, in vivo жағдайында мутация және рекомбинация негізінде жүретін дәстүрлі клеткалық селекциядан айырмашылығы осында.

3 Екінші айтарлықтай айырмашылығы: РДТ - бұл мүлдем түрлі генетикалық материалдарды қосу және клондау (мысалы, прокариот және эукариот организмдер гендерін біріктіру). Ал дәстүрлік селекцияда бүл мүмкін емес. РДТ молекулалық биология, нуклеин қышқылдарының химиясы, гендік- инженерлік энзимология жетістіктері арқылы түраралық, тінаралық тосқауылдарды жеңуге мүмкіндік береді.

4 Дәстүрлік селекция алдымен жаңа штаммпродуценттерді, осімдіктердің жаңа сортын, жануарлардың жаңа түқымын алуда белгілі нәтижелерге қол жеткізеді. Кейін алынған онімнің фенотиптік өзгерістеріне жауапты гендерді анықтауга зерттеулер жүргізеді. Ал РДТ алдымен генетикалық өзгерістердің багдарламасын жасайды, содан кейін өнімді алып фенотиптік қорытындысын жасайды.

5 Кейбір зерттеушілер РДТ гендік микрохирургия деп атайды, бірақ ол рестриктазалар мен лигаза ферменттері арқылы жүзеге асатын химиялық хирургия. Сонымен қатар, РДТ - бүл дәстүрлік селекцияның жалғасы, мутантты организмдер алу кезінде мутация мен рекомбинация-ларды практика жүзінде қолдану нәтижелерініц анализі. Спонтанды және индуцияланған мутациялар, рекомбинацияның әр түрлі әдістері (конъюгация, трансформация), in vitro-дa ДНҚ рекомбинантты молекуласын жасау - мұның бәрі зерттеу нысаны ген болатын клеткалық және молекулалық генетиканың эволюциялық жетістіктері.

6 Бактериалық клетка геномы жалгыз хромосомасында (95-98%) және плазмидасында (2-5%) орналасқан. Тіршілік үшін маңызды генетикалық ақпараттың басым бөлігі хромосомада жиналған суперспиралданған ДНҚ молекуласы ретінде берілген. ДНҚ екі спиральдан түрады, олардың әр қайсысы белгілі нуклеотидтер (аденин, тимин, гуанин, цитозин) тізбегінен түрады. Бұл негіздер комплементарлы: бір тізбектің аденині келесі тізбектегі тиминмен, ал гуанин цитозинмен жұп құрайды. Негіздердің миллиондаған жүптары ген құрылымын қалыптастырады (бір құрылымдық генде мынга жуық негіздер жұбы), соңғылары ақуыз синтезін кодтайды. Құрылымдық гендерге жанасқан негіздер тізбегі - бұл гендердің клеткада - матрицалық РНҚ синтезінің және трансляцияның -мРНҚ-ны рибосомалардағы матрица ретінде қолданумен ақуыз түзілуі экспрессиясын бақылауды жүзеге асырады.

7 Транскрипция промотор және терминатормен реттеледі. Промотор - бүл РНҚ-полимераза ферментімен тығыз байланысатын ДНҚ-ның қысқа фрагменті. Ол ферменттің ДНҚ-матрицасы бойымен қозғалуына ықпал жасайды да, құрылымдық ген басының алдында орналасқан ДНҚ-ның кодтаушы тізбегінің нүктесінде транскрипция процесін инициациялайды. ДНҚ-ның терминатор деген болігі құрылымдық ген соңында орналасып, транскрипция аяқталуының сигналы болып табылады. Промотор мен құрылымдық ген аралығында ДНҚ-ның оператор деген тагы бір бөлігі орналасқан. Ол клеткада метаболизмнің артық концентрациясы жиналғанда арнайы ақуыз- репрессормен байланысып, транскрипция процесін тоқтатады.

8 Рибосомадағы ақуыз трансляциясын реттеуін мРНҚ түзілуі кезінде транскрипцияланған басқа тізбектер жүзеге асырады. Рибосомалардың мРНҚ-ның рибосомамен байланысуына жауапты арнайы бөлігіне жалғасуының арқасында трансляция старттық сигналдан - кұрылымдық геннің бірінші кодонынан басталады. Ген соңындағы "стоп кодон" синтезделетін ақуыздық молекуланың толықтай босануына жағдай жасайды. Кодтаушы бөліктегі өзгерулер ферменттің амин қышқылдық тізбегін өзгертіп, оның бел- сенділігіне эсер етуі мүмкін. Промотор тізбектеріндегі аз ғана өзгерулер оның РНҚ-полимеразамен байланысу мүмкіншілігін арттырып транскрипцияны жылдамдатуы мүмкін. Оператор мен ген-реттеуші аймағындағы мутация репрессордың байланысуына кедергі жасау мүмкін. Нәтижесінде транскрипция нәтижелігін арттырады. Басқа организмдерге көшірілген тендер промотор мен рибосомамен байланысу аймағы қүрылымдық бойынша сәйкес келсе, экспрессияланады

9 Генетикалық код және транскрипция мен трансляцияньщ негізгі биохимиялық реакциялары прокариоттық және эукариоттық клеткаларда "бірдей. Бірақ, эукариоттардың қүрылымдық гендерінде кодтаушы аймақтар (экзондар) арасында кодтамайтын аймақтар интрондар орналасқан. Интрондар экзондармен бірге транскрипцияланады, бірақ экспрессияланбайды.

10 Интрондарды қиып тастап экзондарды біріктіру процесі сплайсинг деп аталады. Сплайсинг нәтижесінде жетілген мРНҚ түзіледі. Одан белок трансляцияланады. Интрондардың болуы прокариоттык клеткаларда рекомбинанттық ДНҚ экспрессиясын қиында-тады. Өйткені бактерияларда сплайсинг процесін жүргізетін ферменттер жоқ. Табиғи эукариоттық ген прокариоттық жүйеде экспрессиялану үшін алдын-ала интрондардан босатылу керек. мРНҚ-ға кері тарнскриптаза ферменті көмегімен ДНҚ-ң комплёментарлы тізбегі (кДНҚ) репликацияланады. Кейін ДНҚ-полимераза ферменті арқылы ДНҚ-ның екінші тізбегі түзіледі. Бөтен ген осылайша клеткареципиентте экспрессияланады.

11 Вирустардың, прокариоттық клетка геномы қүрылымы бойынша өсімдіктер мен жануарлар геномдарымен салыстырғанда қара-пайым, өте күрделі емес. Сондықтан, гендік инженерияда вирустар немесе бактериялар гендерін қолданғанда оларды бөліп алу айтар-лықтай қиындықтар тудырмайды. Ал адам организмінің көптеген тендер жинағы арасынан керекті генді табу мен бөліп алу өте қиын. Сондыктан эукариоттық клеткада керекті геннен транскрипцияланған мРНҚ идентификациялау жүргізу жеңілірек. Жануарлар клеткаларында мРНҚ транскрипииясы клеткалық ядрода жүзеге асады; ядродан цитоплазмаға генетикалық ақпаратты матрицалық РНҚ тасымалдайды, рибосомаларда ақуыз трансляциясы жүріп жатады. Прокариотты клеткаларда қалыптасқан ядролары болмайды, транскрипция және трансляция үрдістері параллель жүріп отырады, ал мРНҚ тура рибосомалармен байланысады.

12 Жоғарыда айтылған транскрипция және трансляция үрдістерінің кейбір ерекшеліктері, генетикальщ ақпараттың іске асу механизмі негізінде рекомбинантты ДНҚ технологиясы жатады. Рекомбинантты ДНҚ технологиясы келесіде: алдымен донор клет-касынан нативті ДНҚ бөліп алынады (клонданатын ДНҚ, енетін ДНҚ, ДНҚ- нысана, бөтен ДНҚ), кейін рестриктаза ферменті көмегімен белгіленген сайтта ажыратады және босатылған генді (тендер) лигаза ферменті қатысуымен ДНҚ тасымалдайтын вектормен байланыстырады (клонданатын вектор), яғни in vitro рекомбинантты ДНҚ молекуласын алуға болады

13 Бірінші этап - баска организмге тасымалдайтын генді (гендер ді) бөліп алу: а) донор ДНҚ-нан оны рестрикциялау, белгілі нуклеоидты катары бар ДНҚ бөліктің эндонуклеаза рестрикциялайтын ферментімен кесіп алу. Осы кезде ДНҚ екі спиральді жібі жазылатын жағынай ыдырайды, "табалдырық" пайда болады - ДНҚ бір жібі бірнеше нуклеотидтерге бөлінеді. Бір жіпті (жабысқақ) шеттері пайда болады. Егер бір түрлі рестриктаза бөлген 2 жабысқақ ДНҚ фрагменті кездесетін болса, қатарлар шеттері компле-ментарлы болғандықтан жеңіл бір- бірімен өзара байланысады.

14 Екінші этап. Донор клеткасынан бөлінген ген нақты құрылымды ақуыз туралы информацияға ие, бірақ өз бетімен клетка-реципиентте іске асыра алмайды. Осы жаңа генді баска организмдерге ендіріп және оның репликациясын қамтамасыз ететін қосымша ДНҚ молекуласы қажет. Осындай генетикалық ақпаратты тасы-малдаушысы (вектор) ретінде плазмидалар, жануарлар вирустары мен бактериофагтарды қолдануға болады. Трансгенді өсімдіктер алуына қолданатын типті вектор Agrobacterium tumefaciens топы-рақ бактериясынан бөлінген Ті-плазмида. Agrobacterium tumefaciens бактериясымен өсімдіктер симбиозды өзара қарым- қатынасқа түседі, Ті-плазмида өсімдік клеткасына трансформациясы барысында "тамырлық жаңғақша - корончатый галл" ауруын тудыратын Т-ДНҚ геномын ендіреді

15 Үшінші этап. Конструкцияланған рекомбинантты ДНҚ реципиент клеткасына ендіреді, түрақты қадағаланады, яғни репликацияланып келесі үрпақтарына ауысып отырады. Трансформацияның нәтижелілігі реципиент клеткасыньщ компетенттілігіне, вектордың экспрессиялаушы белсенділіге, донор мен реципиенттіц генетикалық материалы туысты жақындықта болуына тәуелді.

16 Клеткада рекомбинантты ДНҚ жақсы трансформациялануы үшін протопласт алынады, реципиент клеткасына жылумен эсер етеді, клетка мембранасы еткізгіштігін жоғарлату үшін СаСІ, ері- тіндіс: қосылады. Экспериментте байғалған клеткалардан трансформацияға 1-2 клетка үшырайды. Одан кейін осы клеткалардағы ендірілген рекомбинантты ДНҚ клетка-иесі рестриктазаларынан қорғау керек, олар бөтен ДНҚ деградацияға ұшыратып, ыдыратуы мүмкін. Клеткаға рекомбинантты ДНҚ ендірілген соң оның экспрес-сиясы жүреді (транскрипция және трансляция). Микробтық клет-каға енген бөтен геннің транскрипциясы жүреді, егер осы ген ал-дында клетка-иесінің РНҚ-полимеразаны танитын күшті промотор болған жағдайда ғана. РНҚ полимераза транскрипцияны детерми- нациялайды, ал мРНК рибосомада бөтен ақуыздың синтезін трансляциялайды. Осы жерде де синтезделетін ақуыз клетканың протеазаларымен бедсенді деградацияға үшырамауын қадағалау қажет, яғни клондалған клеткаларда соңғыларды тежеу міндетті.

17 Әдебиеттер: 1. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы медицинской биотехнологии, - М: АСАDЕМА, г. – 207с.Микробиология / Воробьев 2. Избранные вопросы медицинской биотехнологии. Избранные вопросы медицинской биотехнологии. – Сиб.ГМУ, Томск – – 135с. 3. Медицинская микробиология под ред. Покровского В.И. //М. ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1998, 1184 С. 4."Биотехнология: Свершения и надежды". М:Мир, 1987 г. 5.Р.Реннеберг,И.Реннеберг."От пекарни до биофабрики".М:Мир, 1991 г. 6.Дебабов.В.Г. Успехи генной инженерии микроорганизмов. Генетика.1987 г. т.23, N10 с П.О.Вяземский, Волчек и др. Генетическая инженерия в современной медицине. Военно- медицинский журнал.1990 г.N1 с Перспективы применения методов ДНК- диагностики в лабораторной службе.\Клиническая лабораторная диагностика, 5, 2000г