Генетичекий обмен у бактерий Работа студентки Рябчун Александры. - презентация

1 Генетичекий обмен у бактерий Работа студентки Рябчун Александры

2 Генетичекий обмен у бактерий процесс передачи генетического материала у бактерий. Основные пути осуществления: -трансформация -трансдукция -конъюгация Конечным этапом генетического обмена, который может быть как внутривидовым, так и межвидовым, является рекомбинация. Рекомбинация процесс взаимодействия между молекулами ДНК,приводящей к формированию новой рекомбинантной молекулы, несущей признаки от бактерии-донора и от бактерии-реципиента.

3 Рекомбинация Законная Требует наличия протяженных комплементарных участков ДНК в рекомбинируемых молекулах Происходит только между близкородственными видами Незаконная Не требует наличия протяженных комплементарных участков ДНК Происходит при участии Is-элементов, обеспечивающих быстрое встраивание в хромосому

4

5 Трансформация Передача генетического материала между бактериями при помощи фрагментов ДНК. Впервые была воспроизведена Ф.Гриффитсом в 1928 г. Он одновременно вводил в брюшную полость белых мышей авирулентные бескапсульные штаммы пневмококка и убитые капсульные варианты этих бактерий,в результате авирулентные штаммы приобрели вирулентность.

6

7 Условия, необходимые для успешной трансформации : ДНК донора должна быть выделена из бактериальной культуры того же вида, что и реципиент(или близкородственного) Участок трансформирующей ДНК должен сохранять двунитчатую суперспирализцию Концентрация ДНК не должна быть малой или избыточной, в обоих случаях количество рекомбинантов снижается Клетки-реципиенты должны быть компетентными, т.е. способными адсорбировать на своей поверхности ДНК донора и поглощать ее

8 Стадии трансформации 1.Адсорбция ДНК-донора на клетке- реципиенте 2.Проникновение ДНК внутрь клетки- реципиента 3.Соединение ДНК с гомологичным участком хромосомы реципиента с последующей рекомбинацией

9

10 Механизм трансформации

11 Постановка опыта по передаче локуса устойчивости к стрептомицину В опыт берут: ДНК стрептомицинустойчивого штамма Стрептомицинчувствительную культуру в компетентном состоянии Селективную среду, содержащую стрептомицин Последовательность действий: 1. Компетентные клетки реципиента соединяют с ДНК донора и инкубируют в течение 30 минут для контакта. 2.В пробирку вносят раствор фермента ДНК-азы для разрушения не проникшей в реципиентные клетки ДНК. 3.Полученную смесь высевают на чашки с селективной средой и инкубируют. 4.Делают контрольные высевы ДНК донора и культуры- реципиента на селективной среде.

12 Результаты опыта: 1.В обоих контролях рост колоний отсутствует. 2.На опытных чашках вырастают колонии рекомбинантов, которые приобрели признак стрептомицинустойчивости. С помощью данного опыта можно определить частоту трансформации – отношение числа выросших рекомбинантов к числу реципиентных клеток.

13 Трансдукция процесс переноса генетического материала от бактерии-донора к бактерии- реципиенту с помощью бактериофага специфическая неспецифическая (локализованная) (общая) абортивная

14 - бактериофаг переносит любые гены донора; - неспецифическую трансдукцию осуществляют вирулентные фаги; - включение ДНК клетки- рецепиента (фиолетовая) при сборке фага носит случайный характер Неспецифическая трансдукция:

15 Основные этапы: Адгезия на поверхности бактерии-донора с последующим проникновением Размножение бактериофага внутри клетки Самосборка фаговых частиц и образование дефектного бактериофага (сохраняет инфекционные свойства и содержит какой-либо фрагмент ДНК бактерии донора) Перенос дефектным бактериофагом включенной ДНК в клетку-реципиент Рекомбинация и включение перенесенной ДНК в клетку- рециент, а следовательно, изменение ее свойств

16 Специфическая трансдукция фаг переносит определенные гены от бактерии-донора к бактерии-реципиенту Перенос гена lac+ с помощью фага Р1

17 Основные этапы: Интеграция ДНК умеренного бактериофага в определенный участок хромосомы клетки-донора Захват соседних бактериальных генов (например, «gal» или «bio») при выходе из хромосомы Формирование дефектного бактериофага (потерян фрагмент собственной ДНК фага, но захвачен фрагмент ДНК донора) Перенос захваченного фрагмента ДНК донора в клетку- реципиент Включение его в геном клетки-реципиента посредством рекомбинации

18 Абортивная трансдукция- трансдукция, при которой перенесенный материал передается только одной из двух дочерних клеток.

19 Основные этапы: Формирование дефектного бактериофага, который содержит фрагменты собственной ДНК и ДНК донора Перенос дефектным бактериофагом включенной ДНК в клетку-реципиент Внесенный фагом фрагмент донорной ДНК не интегрирует в бактериальную хромосому и не реплицируется Однолинейное наследование донорного гена и в конечном итоге утрачивается в потомстве

20 Постановка опыта по передаче локуса «gal+» В опыт берут: Трансдуцирующий фаг, выделенный из «gal+» E.coli Бульонную культуру-реципиента E.coli «gal-» Среду ЭМС (селективная, дифференциально- диагностическая). «gal+» колонии – сине-черные; «gal-» колонии – неокрашенные. Последовательность действий: 1.В опытную пробирку вносят культуру-реципиент и фаголизат трансдуцирующего фага, инкубируют в течение 30 минут 2.Из полученной смеси готовят разведения, делают высевы на чашки с ЭМС-средой, инкубируют 3.Делают контрольные высевы фаголизата и культуры- реципиента на чашки с ЭМС-средой

21 Результаты опыта: 1.В контроле культуры-реципиента выросли бесцветные «gal-» колонии 2.На опытной чашке: бесцветные «gal-» колонии культуры-реципиента и сине- черные «gal+» колонии рекомбинантов С помощью данного опыта можно определить частоту специфической трансдукции – отношение числа выросших рекомбинантов к числу участвующих в опыте реципиентных клеток.

22 Конъюгация Необходимое условие : наличие в клетке-доноре трансмиссивной плазмиды. Процесс конъюгации у бактерий впервые был обнаружен Джошуа Ледербергом и Эдвардом Тейтумом в 1946 г. форма обмена генетическим материалом между бактериями при их непосредственном клеточном контакте.

23 Этот процесс контролируется F-плазмидами (F- факторами), которые, находясь в цитоплазме клетки, могут реплицироваться автономно(F + - клетки), а могут быть интегрированы в бактериальную хромосому, тогда это Hfr-штаммы Выщепляясь из бактериальной хромосомы,могут захватывать часть бактериальных генов и становиться автономными, тогда образуется F- плазмида Доноры: F + -клетки («мужские», содержат F- плазмиду ) Реципиенты: F - клетки(«женские», не содержат F- плазмиду )

24 Механизм конъюгации

25 Основные этапы: Прикрепление клетки-донора к реципиентной клетке с помощью половых ворсинок Образование между обеими клетками конъюгационного мостика Разрыв и деспирализация одной из нитей ДНК, проникновение проксимального конца в клетку- реципиент через конъюгационный мостик Достраивание второй нити ДНК в клетке-реципиенте и восстановление ДНК-донора

26 Типы скрещивания: 1.Скрещивание F + x F - :передается только F-плазмида, при этом F - клетка становится F + -клеткой,приобретая плазмиду и свойства донора. Хромосомные гены не передаются. 2.Скрещивание Hfr x F - : (есть рекомбинанты) передаются бактериальные гены. Для проникновения всей хромосомной нити требуется много времени и, как правило, полный переход осуществляется редко, соответственно, гены, расположенные в той части хромосомы, которая не успела проникнуть в реципиентную клетку, не передаются вообще. Поэтому клетки-реципиенты при таком скрещивании, как правило, не становятся донорами 3.Скрещивание F x F - : (есть рекомбинанты) происходит аналогично скрещиванию F + x F - и реципиентная клетка превращается в донорную

27 Постановка опыта скрещивания Hfr x F - по передаче локусов Pro, Thr, Leu В опыт берут: Донор-штамм с генотипом Pro +, Thr +, Leu +, чувствительный к стрептомицину Реципиент-штамм с генотипом Pro -, Thr -, Leu -, резистентный к стрептомицину Селективную среду, содержащую стрептомицин Последовательность действий: 1.В опытную пробирку вносят культуры донора и реципиента, инкубируют в течение 30 минут 2.Готовят разведения и высевают на селективную среду, инкубируют 3.Делают контрольные высевы культуры донорных и реципиентных клеток на чашки с селективной средой

28 Результаты опыта: 1.На контрольных чашках рост отсутствует 2.На опытной чашке вырастают рекомбинанты С помощью данного опыта можно определить частоту рекомбинаций – отношение числа выросших рекомбинантов к числу участвующих в опыте реципиентных клеток.