Фрагментный анализ ДНК к.б.н.,Орехов В.А. ООО «ГОРДИЗ» 29 января 2013 г. г. Звенигород. - презентация

1 Фрагментный анализ ДНК к.б.н.,Орехов В.А. ООО «ГОРДИЗ» 29 января 2013 г. г. Звенигород

2 Что такое фрагментный анализ ДНК? Фрагментный анализ ДНК – метод (методы) определения длины ПЦР-продуктов основанные на разделении фрагментов ДНК по молекулярной массе. HPLC (ВЭЖХ) Масспектрометрия Электрофорез

3 0 Принцип электрофореза

4 30 Принцип электрофореза

5 45 Принцип электрофореза

6 90 Принцип электрофореза

7 Электрофорез ДНК в геле денатурация

8 Анализ фрагментов ДНК в ПААГ -Широко использовался до конца 90-х Преимущества: - Не требует дорогостоящего оборудования - Не требует модифицированных праймеров Недостатки: - Высокая трудоемкость - Низкая пропускная способность - Высокая себестоимость анализа (?) - Низкая точность определения размера фрагментов (?)

9 Стеллан Хьертен Первый автоматизированный прибор для ккапиллярного электрофореза-1967 Университет Упсала(Швеция) От гелей к капиллярному электрофорезу Капилляры Ø3 мм Не приспособлен для анализа ДНК

10 История ккапиллярного электрофореза ДНК 1988 – Разделение однонитевых олигонуклеотидов в капиллярах заполненных поперечно сшитым гелем (Karger et al., деградация, нет возможности пере заполнения) 1990 – разделение продуктов рестрикции ДНК в жидком полимере (Karger et al., недостаточное разрешение) 1992 – первый коммерческий прибор для капиллярного электрофореза, оснащенный лазером для одноцветной лазерной детекции Beckman P/ACE – Первая демонстрация типирования микро сателлитных маркеров с помощью CE (внутренний стандарт – 2 фрагмента и аллельный лэддер TH01) 1995 – многоцветный генетический анализатор ABI 310 Genetic Analyzer Методу > 20 лет

11 150 bp 300 bp TH01 allelic ladder Декабрь 1993 Первый анализ STR с помощью CE, 1993 Одноцветный формат Butler et al. (1994) BioTechniques 17:

12 ABI 3100, 3130XL 16-capillary array ABI 310 single capillary Приборы ккапиллярного электрофореза

13 Преимущества использования автоматических генетических анализаторов 1.Автоматизация: внесение образца, электрофорез и детекция полностью автоматизированы. 2. Высокая скорость анализа (16 образцов х локусов = > 160 маркеров за 30 мин.) 3. Документирование результатов: Результаты автоматически сохраняются в электронном легко доступном виде. 4. Высокая воспроизводимость результатов изо дня в день (в стандартных условиях!) 5. Точность определения размера фрагментов > 0.5 п.н. (в стандартных условиях!) 6. Автоматическая идентификация аллельных вариантов. 7. Cтандартизация vs. традиционный электрофорез

14 Система ккапиллярного электрофореза Буфер Аргоновый лазер 488 нм Анализ результатов Капилляр 50 µm заполненный линейным полимером Буфер Образец в формамиде 5-20 kV 50-60°С Капилляр + -

15 Внесение образца в капилляр (инжекция) Образец в формамиде + размерный стандарт ДНК - - Электрод Капилляр ДНК - - Пример: Инжекция 3 кВ - 5 секунд Количество вносимой ДНК обратно пропорционально ионной силе раствора –> HIDI Формамид Удаление солей позволяет повысить уровень сигнал.

16 Разделение фрагментов Капилляры - 50µm, длина 43 см (36 см до детектора) Пористый матрикс – Поли-диметил акриламид (ПДМА) + 8 M мочевина + 5% 2-пирролидон ( Коммерческие полимеры: POP-4, POP-6,POP-7) Буфер: 100 mM TAPS + 1 mM ЭДТА (pH 8.0) TAPS (N-Tris-(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropane-sulfonic acid) не меняет pH при изменении температуры Напряжение: 5-20 kV

17 Флуоресцентная детекция При поглощении энергии света определенной длины волны происходит возбуждение флуоресцентной молекулы. Это состояние нестабильно. Молекула быстро возвращается в исходное состояние испуская энергию в виде света определенной длины волны. 6FAM (желтый), R6G (оранжевый), TAMRA (красный) 5-меченые праймеры (хранить в темноте!)

18 FAM (Синий)JOE (Зеленый)TAMRA (Желтый)ROX (Красный) Флуоресцентные красители для праймеров Основание ДНК Краситель 520 нм 548 нм 580 нм 605 нм linker Производители используют разные линкеры

19 ABI 310 Filter Set F Длина волны (nm) FAM JOENEDROX Возбуждающий лазер (488, nm) Возбуждающий лазер (488, nm) Нормированная интенсивность флуоресценции Спектры испускания красителей

20 Изображение, снимаемое CCD камерой в 16-капиллярном приборе

21 Виртуальные фильтры nm Filter A Filter C Filter F Filter G5 FL FAM TET VIC JOE HEX NED TMR PETROXLIZ Используемые красители Filter sets определяет какой регион CCD камеры активен и какая часть видимого света будет регистрироваться Стрелками указаны максимумы испускания красителей

22 5 x 5 матрикс - ABI 310 6FAM VIC NED PET LIZ Сырые данные с матриксным стандартом Данные после применения матрикса From Identifiler Users Manual До 6 красителей одновременно (до 24 STR маркеров )

23 Мультиплексная ПЦР – одновременный анализ нескольких маркеров

24 Анализ мультиплексной реакции GeneMapper (Life Technologies) GeneMarker (…)

25 Полиморфизмы ДНК выявляемые фрагментным анализом 1. Микросателлиты – STR (Short Tandem Repeat) 2. Однонуклеотидные полиморфизмы - SNP (Single nucleotide polymorfism) 3. Инсерции/делеции - InDels X Y 6 п.н. делеция TCAT Область повторов AGACTAGACATT AGATTAGGCATT

26 Анализ микросателитных маркеров (STR). AnimalType Pig (BioType, Германия)

27 Размерный стандарт Размерный стандарт – набор флуоресцентно меченных фрагментов известной длины, стабильной подвижности В диапазоне 100 – 500 п.н. зависимость размера от скорости линейная

28 Определение относительных размеров фрагментов ДНК Метод Local Southern

29 Аллельная лестница (лэддер) AnimalType Pig (BioType, Германия) Стандартный набор аллелей В природе аллелей больше

30 Зачем нужен аллельный лэддер? Аллельный лэддер Форез 1 Генотип: 181,37/185,35 Форез 2 Генотип: 179,52/183,40

31 Большой мультиплекс не всегда эффективно работает Деградация -> миниSTR

32 Область STR -повторов miniSTR праймер Обычнй праймер Длиный ПЦР продукт в составе большого мультиплекса MiniSTR miniSTR: принцип Butler, J.M. (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition, Figure 7.2, ©Elsevier Science/Academic Press ~150 п.н. короче

33 Влияние количества ДНК -A +A 10 ng избыток матрицы 2 ng оптимальное количество DNA Size (bp) Relative Fluorescence (RFUs) 100 pg 5 pg DNA Size (bp) Оптимум ng при 30 циклах

34 Избыточное количество ДНК в реакции Повтор ПЦР с нормированным количеством ДНК (1 нк) – полный профиль Избыточное количество ДНК в реакции –> перегруз Матрикс не работает Повторное внесение ДНК с уменьшенной инжекцией –> отсутствие длинных фрагментов

35 Артефакты ПЦР: Неполное аденилирование -A +A Способы предотвратить неполное аденилирование: 1. Продолжительный прогрев при 68-72°С после завершения программы ПЦР (до 1 часа) 2. Контроль количества вносимой ДНК (не хватает активности полимеразы) 3.«Волшебный хвост» для немеченого праймера с последовательностью, промотирующей аденилирование: 5-G- 5- ATA- 5- GTTTCT- 5- GTGTCTT-

36 Артефакты ПЦР: Статтеры Статтеры 6.3%6.2%5.4% Аллели GATA CTAT GATA 5 4 C TA T Уровень стартеров зависит от - размера повтора (ди-, три, тетра, пента) - числа повторов - количества циклов

37 Артефакты: DyeBlob Праймеры плохо очищены После очистки ПЦР-продукта на колонках Необходимо требовать от поставщиков праймеров двойной очистки: ВЭЖХ + ПААГ

38 Анализ инсерций/делеций - Большой потенциал мультиплексности - Эффективность амплификации выше чем для микро сателлитов -> высокая чувствительность - Отсутствие артефактов ПЦР (стартеров)

39 Анализ однонуклеотидных замен - SNaPshot

40 Принцип MLPA