Изучение регуляции ростовых процессов каллусной культуры Trigonella foenum – graecum, или пажитника греческого Научный руководитель: доцент, к.б.н. Дитченко. - презентация

1 Изучение регуляции ростовых процессов каллусной культуры Trigonella foenum – graecum, или пажитника греческого Научный руководитель: доцент, к.б.н. Дитченко Т.И.

2 Актуальность Растения являются уникальными источниками многих биологически активных соединений. Несмотря на успехи в области применения синтетических лекарств, препараты природного происхождения приобретают все больший вес в практической медицине. Их несомненными преимуществами является широкий спектр биологической активности и экологическая безопасность изготовления, что особенно важно в наше время. Однако в связи с увеличивающимся дефицитом и стоимостью лекарственного растительного сырья, получаемого, как правило, из экзотических, редких и исчезающих видов диких и плантационных растений, на сегодняшний день не представляется возможным полностью обеспечить потребности фармакологической, косметической, а также пищевой промышленности в биологически активных соединениях растительного происхождения. Поэтому в условиях, когда необходимо постоянно увеличивать долю лекарственных субстанций отечественного производства, представляется важным развивать технологии, создающие надежную сырьевую базу для выработки отечественных препаратов.

3 В связи с этим большой практический интерес представляют приемы получения фитомассы, основанные на культивировании в искусственных условиях на питательных средах растительных клеток. Обладая рядом преимуществ, этот метод составляет альтернативу природным источникам ценных соединений: 1.Это радикальное решение проблемы дефицита исходного сырья, возможность получения целевого продукта в течение всего года, полная независимость от климата, погоды, почвенных условий, вредителей, а также значительная экономия площадей, занимаемых культивируемыми растениями. 2.Использование вместо интактных растений их клеточных культур значительно расширяет возможности управления процессом биосинтеза целевых продуктов. 3.В результате оптимизации и стандартизации условий культивирования, содержание ценных метаболитов в растительных клетках in vitro и их качественный состав могут превышать таковые в интактных растениях.

4 Цель работы Целью настоящей работы было исследование регуляции ростовых процессов каллусной культуры Trigonella foenum – graecum, или пажитника греческого. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1.Получение культуры клеток пажитника греческого и исследование эффективности процесса каллусогенеза под влиянием экзогенных ауксинов и цитокининов. 2.Определение ростовых характеристик полученной каллусной культуры. 3.Изучение влияния состава питательной среды на скорость прироста биомассы каллусной культуры пажитника греческого.

5 Объектом исследований был выбран пажитник греческий - одно из древнейших лекарственных растений, история применения которого насчитывает несколько тысячелетий. Как официальное лекарственное растение оно включено в ряд европейских и других фармакопий. Лекарственным сырьем обычно служат семена, экстракты из которых обладают противовоспалительными, антихолестеринными, тонизирующими, антианемическими, антигельминтными и другими терапевтическими эффектами. В настоящее время препараты, изготовленные из пажитника, с успехом используются при лечении диабета типа ΙΙ или инсулиннезависимого диабета. Семена Trigonella также используют как биологически активную добавку к пище для повышения аппетита. Надземные части пажитника, собранные в конце лета, являются народным средством от спазмов различного происхождения.

6 Основными биологически активными веществами пажитника греческого являются стероидные сапогенины (в первую очередь, диосгенин), фитостерины, алкалоид тригонеллин, никотиновая кислота, флавоноиды, эфирные масла и др. В настоящее время сапогенины широко используются в фармацевтической промышленности для синтеза гормональных препаратов. Кроме того, у этих соединений была обнаружена способность тормозить рост некоторых форм злокачественных образований; снижать уровень холестерина в крови, а также антигрибная фунгицидная, антибактериальная и антивирусная активности. Наибольшее значение среди стероидных сапогенинов имеет диосгенин. Основными поставщиками сырья для промышленного производства диосгенина является Мексика, страны Центральной Америки, Индия и Китай, где для массовой заготовки используются различные виды диоскореи, паслена и пажитника. В нашей стране отсутствие исходного сырья для медицинской промышленности восполняется за счет импортируемого диосгенина.

7 Таким образом, изучение условий, способствующих быстрому приросту биомассы культуры клеток пажитника греческого как альтернативного источника многих биологически активных соединений, представляется важной и актуальной задачей.

8 Методика исследований Для культивирования растительных объектов in vitro была использована основная питательная среда Мурасиге-Скуга с добавлением фитогормонов. Среда содержала: макроэлементы; микроэлементы; источник углерода (сахароза); витамины. Для приготовления твердой среды был использован агар в концентрации 7-8 г/л. Величина pH питательных сред до автоклавирования составляла 5,7-5,8. Для получения каллусов Trigonella foenum – graecum использовались среда Мурасиге-Скуга с 6 комбинациями фитогормонов.

9 Варианты питательных сред МS (использованные для получения каллусов пажитника греческого) кинетин 2,4-Д 1,0 мг/л1,5 мг/л 0,5 мг/л12 1,0 мг/л34 1,5 мг/л56

10 Ход работы Первым этапом исследований было получение стерильных растений пажитника греческого. Проводилась многоступенчатая стерилизация семян с последующей посадкой их в стандартную питательную среду. Все манипуляции были проведены с соблюдением правил ассептики в ламинарбоксе. После прорастания семян производили их пересадку в коничесие колбы объемом мл, содержащие безгормональную питательную среду MS, в которых и производилось их дальнейшее выращивание в условиях фитостата.

11 Для получения каллусов пажитника греческого были использованы листовые и стеблевые экспланты. Все операции осуществлялись с соблюдением правил асептики в ламинарбоксе. Листовые пластинки и стебли разрезали на части длиной 0,5 см и переносили в чашки Петри с питательной средой 6 вариантов, различающихся концентрацией фитогормонов кинетина и 2,4-Д. Чашки герметично заклеивали пищевой пленкой, помещали в термостат и культивировали при температуре 24,6ºС.

12 Результаты и их обсуждение В результате было установлено, что наиболее эффективное формирование каллусов наблюдается в случае применения следующих сочетаний фитогормонов: вариант 2 – 1 мг/л кинетина + 1 мг/л 2,4- Д; вариант 4 – 1,5 мг/л кинетина + 0,5 мг/л 2,4-Д; вариант 5 – 1,5 мг/л кинетина + 1 мг/л 2,4-Д. В случае использования других вариантов питательных сред степень дедифференциации клеток эксплантов и каллусогенез были менее выражены. Возможно, причиной этого являлось накопление фенольных соединений в травмированных клетках эксплантов, а также несбаллансированность фитогормонального состава питательной среды.

13 Зависимость ростовых показателей каллусной культуры Silybum marianum от гормонального состава питательной среды Изучение влияния соотношения фитогормонов на ростовые показатели каллусной культуры Trigonella foenum – graecum включало определение следующих параметров: удельной скорости роста и времени удвоения биомассы. Удельная скорость роста: где Wo – начальная масса каллуса, г; Wt – масса каллуса в конце цикла выращивания, г; t – продолжительность культивирования, сут. Время удвоения биомассы: где V – удельная скорость роста. (W t – W 0 ) Δt·W 0 V = In 2 V μ =

14 Согласно полученным результатам, наиболее высокие значения удельной скорости роста были установлены для каллусов, культивируемых на питательных средах, содержащих 1,0 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л кинетина, а также 1,0 мг/л 2,4-Д и 1,5 мг/л кинетина. Их величины составляли 0,078 и 0,066 г/сутки соответственно. Наиболее низкие величины удельной скорости роста каллусных культур были характерны для следующих вариантов питательных сред: 1) вариант 6 (1,5 мг/л 2,4-Д и 1,5 мг/л кинетина); 2) вариант 3 (1,5 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л кинетина); 3) вариант 1 (0,5 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л кинетина). Они были в среднем в 2,5 раза ниже по сравнению с питательной средой, содержащей 1,0 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л кинетина, также в 2 раза- по сравнению с питательной средой, включающей 1,0 мг/л 2,4-Д и 1,5 мг/л кинетина.

15 На следующем этапе была произведена оценка влияния соотношения концентраций ауксинов и цитокининов в питательной среде на время удвоения биомассы каллусной культуры Trigonella foenum – graecum. Из рисунка видно, что минимальное время удвоения биомассы (8,8 суток) было характерно для каллусов, культивируемых на питательной среде, содержащей 1,0 мг/л 2,4-Д и 1,0 мг/л кинетина. Для каллусов, которые выращивались на питательной среде MS, включающей 0,5 мг/л 2,4-Д и 1,5 мг/л кинетина, данный показатель составлял в среднем 16,5 суток. Для 1, 3 и 4 вариантов питательной среды MS были обнаружены практически равные значения времени удвоения биомассы - от 25 до 26 суток. Наиболее высокий показатель времени удвоения биомассы был характерен для питательной среды MS, содержащей 1,5 мг/л 2,4-Д и 1,5 мг/л кинетина (вариант 6). В данном случае время удвоения биомассы составляло около 35 суток.среды

16 Заключение В результате проведенных исследований была получена устойчивая каллусная культура Trigonella foenum – graecum, или пажитника греческого. Показано, что для индукции каллусогенеза у эксплантов пажитника греческого наиболее оптимальной является питательная среда с сочетанием фитогормонов 1,0 мг/л 2,4-Д + 1,0 мг/л кинетина, а наименее – 1,5 мг/л 2,4-Д + 1,5 мг/л кинетина.среда Результаты исследования влияния фитогормонов на показатели роста полученной каллусной культуры пажитника греческого свидетельствуют, что максимальное значение удельной скорости роста (0,078 г сыр.м./сут) и соответственно минимальное время удвоения биомассы (8,8 сут) характерно для питательной среды, содержащей 1,0 мг/л 2,4-Д и 1,0.среды

17 СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ