Культуры клеток растений (ККР), как источник получения биологически активных веществ (БАВ) - презентация

1 Культуры клеток растений (ККР), как источник получения биологически активных веществ (БАВ)

2 Исторические аспекты Конец ХIХ – начало ХХ века –Х.Фехтинг, С.Рехингер, Дж.Хаберланд – первые попытки стимуляции роста растительных тканей и органов В.Роббинсон, В.Котте - доказали возможность выращивания кусочков корневых меристем на синтетической пит.среде 1932 – Р.Готре, Ф.Уайт – возможности неограниченного во времени роста при периодической пересадке 1952 – 142 вида высших растений, выращиваемых в стерильной культуре 1955 – Ф.Скуг и С.Миллер – открытие цитокининов. Доказана возможность при их сочетании с ауксинами стимуляции деления клеток, поддержания роста каллусной ткани, индукции морфогенеза в контролируемых условиях метод промышленного выращивания клеточных суспензий 1960 – Е.Коккинг – метод получения изолированных протопластов и получения соматических гибридов Р.Г.Бутенко – метод клонального микроразмножения, метод культивирования одиночной клетки с помощью ткани-няньки

3 Методы и условия культивирования Асептика Питательные среды Физические факторы

4 Питательные среды Многокомпонентные среды: макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, фитогормоны и их синтетические аналоги. Углеводы 2-3 %. (большинство каллустных тканей лишено хлорофилла и не способно к автотрофному питанию, их выращивают в условиях рассеянного освещения или в темноте). Ауксины - вызывают дедифференцировку клеток экспланта, Цитокинины - индуцируют клеточные деления. При изменении соотношения между этими фитогормонами или при добавлении других фитогормонов могут быть вызваны разные типы морфогенеза. Высокое содержание NO 3 -, NH 4 +, K +, PO 4 3- способствует быстрому росту клеток. Истощение среды снижает рост и процессы вторичного метаболизма. изначально низкое содержание PO 4 3- в питательных средах стимулирует синтез вторичных метаболитов. твердые питательные среды для поверхностного культивирования с добавлением агарозы среда Мурасиге и Скуга – (универсальна) пригодна для образования каллусов, поддержания неорганизованного каллусного роста, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений

5 Физические факторы Свет - большинство каллусных тканей могут расти при слабом освещении или в темноте, (не способны фотосинтезировать). Свет активизиреут морфогенез и процессы вторичного синтеза, влияет на метаболизм. Источник света - люминесцентные лампы. Для большинства растений оптимум интенсивности освещенности около 1000 люкс. Слишком низкая (300 люкс) или высокая (3000 – люкс) освещенность подавляет рост, (в культурах чайного растения свет увеличивает биосинтез полифенолов, в культуре Scopolia parviflora свет подавляет образование алкалоидов). Температура - влияние на метаболизм клеток in vitro изучено слабо. Для большинства каллусных культур оптимум 26° С. (культуры диоскореи дельтовидной хорошо растут при температуре 32° С). Индукция морфогенеза ° С. Есть данные, что максимальное образование алкалоидов при температуре 25°С. В суспензионных культурах клеток Ipomoea содержание жирных кислот значительно увеличивалось, если их выращивали при субоптимальных температурах роста (15°С). Аэрация – необходима всегда: в больших объемах ферментеров - в суспензионной культуре подача воздуха снизу, в малых объемах (в колбах) - постоянное перемешивание суспензии Влажность - в помещении, где растут культуры, должна составлять %.

6 дедифференцировка Каллусная ткань образуется в результате повреждения на целых растениях, а также в стерильной культуре на эксплантах – фрагментах ткани или органа, используемых для получения первичного каллуса. Возникновение каллуса связано с неорганизованным делением (полиферацией) дедифференцированных клеток. В процессе дифференцировки клетки теряют способность делиться. Дедифференцировка – основа создания каллусной ткани, – это возвращение клеток в меристематическое состояние, при котором они сохраняют способность к делению. У интактных растений дедифференцировка и индукция каллусогенеза возникают вследствие образования раневых гормонов (травматиновая кислота) при механическом повреждении. Обязательное условие дедифференцировки тканей экспланта и превращения их в каллусные клетки, помимо повреждения, - присутствие ауксинов и цитокининов.

7 Функции гормонов в каллусогенезе: Ауксины: 2,4 дихлорфеноксиуксусная кислота, индолил-3-уксусная кислота, ά- нафтилуксусная кислота – дедифференцировка клетки, подготавка ее к делению, индуцируют синтез главной протеинкиназы клеточного деления Р34 cdc2 ; цитокинины : кинетин, 6-аминопурин, зеатин – инициация деления клеток, индукция синтеза – циклинов действие гормонов проявляется только совместно В процессе дедифференцировки, клетки утрачивают характерные черты исходной ткани (теряют запасные вещества – крахмал, белки, липиды, разрушаются специализированные клеточные органеллы - хлоропласты, аппарат Гольджи, перестраиваются ЭПР и элементы цитоскелета, возрастает число амилопластов) через несколько часов после перенесения экспланта в условия in vitro начинается новый синтез белка обусловленный механическим повреждением и действием гормонов, сохранившихся в экспланте с момента его изоляции из растения, когда данные гормоны израсходуются, синтез белка прекращается, а в присутствии ауксинов и цитокининов - начнется каллусогенез первичный каллус образуется в результате дидефференцировки и деления клеток

8 Типы культур клеток и тканей Каллусная (поверхностное культивирование): Плотные ткани с зонами редуцирования камбия и сосудов Ткани средней плотности с хорошо выраженными меристематическими очагами (органогенез) Рыхлые ткани, сильно обводненные, легко распадающиеся на отдельные клетки (получение суспензии) Суспензионная (глубинное культивирование) суспензии из каллусных тканей рыхлого типа (или плотного исключив из питательной среды соли Са²+), можно культивировать ткань на среде, содержащей ауксин, 2,4-D или ферменты – пектиназу (0,2 мг/л) и целлюлазу (0,01 мг/л). суспензии из экспланта по методу Ф. Стюарта - эксплант помещают в жидкую среду при постоянном автоматическом перемешивании, дедифференцированные клетки отрываются от экспланта, образуя суспензию в питательной среде. Постоянное встряхивание – необходимое условие культивирования клеточных суспензий. суспензионные культуры представлены разными агрегатами каллусных клеток. Прикладные аспекты суспензионных культур: получение изолированных протопластов для клеточной селекции и клеточной инженерии (введение чужеродных ДНК) для получения вторичных метаболитов, выявления новых веществ, для выращивания клеточной биомассы.

9 культура одиночных клеток - в клеточной селекции для отбора гибридных клеток и их клонирования, для генетических и физиологических исследований (изучение причин генетической неоднородности с использованием клона, а не гетерогенной ткани исходного экспланта). особенности: одиночная клетка живет, но не делится в условиях разработанных для нормального роста и размножения клеток каллусной ткани. Метод культивирования основан на использовании кондиционирующего фактора - метаболитов, выделяемых в среду делящимися клетками. Когда на питательную среду высаживается одна клетка или небольшое их количество, они не делятся, так как выделяемого кондиционирующего фактора не хватает для индукции деления. Следовательно, необходимо повысить концентрацию фактора в питательной среде. 1. Метод ткани-няньки - кондиционирующий фактор выделяется находящимися рядом с одиночной клеткой кусочками ткани-няньки. 2. Метод кормящего слоя - кондиционирующий фактор выделяют активно делящиеся клетки суспензионной культуры того же вида растений, что и одиночная клетка. 3. Кондиционирование среды – осуществляется путем добавления в нее питательной среды, отфильтрованной от интенсивно делящихся клеток. 4. Метод культивирования одиночных клеток – осуществляется в микрокапле, т. е. в очень малом объеме (20 мкл) богатой питательной среды (Ю. Ю. Глеба).

10 Характеристика каллусных клеток Каллусная клетка имеет свой цикл развития, аналогичный циклу других клеток. особенности физиологические свойственные клеткам растения - морозостойкость, устойчивость к абиотическим факторам (температура, засоление, фотопериодическая реакция), способность к синтезу вторичных метаболитов. особенности характерные для каллусов - длительно культивируемые in vitro клетки высших растений (каллусные и суспензионные), образуют специфическую популяцию соматических клеток, характеризующуюся физиологической асинхронностью и генетической гетерогенностью. Физиологическая асинхронность (наиболее важное свойство неполовой популяции) - в каждый данный момент времени клетки находятся в разных стадиях роста: одни делятся, другие растут, а третьи уже стареют. (общее физиологическое состояние популяции оценивают по состоянию большинства клеток).

11 Причины асинхронности: 1. Особенности вида, сорта, генотипа индивидуального растения, и особенности экспланта. 2. Стрессы культивирования, например неоптимальная для данного вида клеток среда. 3. Изменение баланса эндогенных гормонов и концентрации в среде экзогенных гормонов в течение выращивания. 4. Генетическая гетерогенность клеток и клонов. 5. Аномалия митотического цикла клеток in vitro. 6. Физические факторы (температура, свет, аэрация). Асинхронность – устойчивое свойство популяции каллусных клеток. Если с помощью специфических воздействий синхронизировать пролиферацию клеток популяции, то уже через деления она вновь становиться асинхронной.

12 Генетическая гетерогенность – свойство клеток соматической популяции (нестабильность генома и их генетическая разнородность). В не меристематических тканях при культивировании возникают полиплоидия, анеуплоидия, хромосомные аберрации, генные мутации. Генетическая гетерогенность - необходимое условие существования популяции клеток и основа для их адаптации. причины генетической гетерогенности: 1. Генетическая гетерогенность исходного материала. (различная плоидность, диплоидны только активно делящиеся меристематические клетки). 2. Нарушение коррелятивных связей при выделении первичного экспланта из растения. 3. Действие компонентов среды. Экзогенные гормоны и стимуляторы могут оказывать мутагенное действие. Ауксины ( 2,4-D) - мутагены; цитокинины способствуют полиплоидизации клеток. 4. Длительное субкультивирование, при котором накапливаются генетически измененные каллусные клетки. После 5 – 6 пересадок новый кариотип клеточной популяции, как правило, стабилизируется, если условия культивирования остаются постоянными. В противном случае изменение физических или трофических факторов приведет к новым генетическим изменениям. значение для селекционной работы : клетки с измененным генотипом могут обладать уникальными свойствами (повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам, повышенной продуктивностью и т.д), но генетическая гетерогенность популяций каллусных клеток в культуре не влияет на сохранение в их геноме основных качеств вида и растения-донора.

13 Гормоннезависимость - автономность по отношении к ауксинам и цитокининам, возникающая при длительном культивировании практически у всех тканей. Ткани могут расти на среде без гормонов, как опухолевые клетки в отличие от нормальных каллусных тканей. Внешне гормоннезависимые ткани ничем не отличаются от каллусных. Хотя гормоны и вызывают мутации, каллусные ткани от большинства растений образуются только в присутствии в питательной среде и ауксинов, и цитокининов. Клетки, которые в процессе культивирования приобрели свойство гормоннезависимости, называются привыкшими. Ткани, образованные привыкшими клетками, называют химическими опухолями (в отличие от растительных или генетических опухолей). Генетические опухоли возникают на межвидовых гибридах растений. Растительные опухоли имеют бактериальное или вирусное происхождение. Чаще всего растительные опухоли возникают при попадании в растения агробактерий.

14 Agrobakterium tumefaciens вызывает образование корончатых галлов, A. rhizodenes – бородатого корня, А.rubi – стеблевого галла. Превращение растительных клеток в опухолевые обусловлено проникновением в них ДНК бактериальной клетки, так называемой Тi- плазмиды, которая изменяя свойства клетки, экспрессирует гены, контролирующие синтез ауксинов и цитокининов. Гормоннезависимость привыкших клеток связана с изменением активности собственных генов, ответственных за синтез белков- ферментов, участвующих в синтезе гормонов, а у растительных опухолей носит генетический характер. отличие привыкших и опухолевых клеток от обычных каллусных: опухолевые и привыкшие ткани не способны к нормальной регенерации, они могут образовывать уродливые органоподобные структуры, тератомы. (В отдельных случаях у длительно культивируемых тканей удается отодвинуть порог привыкания благодаря изменению состава питательных сред и добиться регенерации нормального растения).

15 Дифференцировка каллусных тканей. Одна из наиболее интересных, но сложных проблем в биологии – развитие многоклеточных организмов. Преимущество моделирования процессов онтогенеза на более простых системах (изолированные ткани, клетки, протопласты, культивируемые в стерильных условиях) состоит: 1. в отсутствии необходимости постоянно учитывать результаты взаимодействия органов в целостной системе растительного организма. 2.в возможности выбора условий и повторов опыта в соответствии с поставленной задачей. После дедифференцировки развитие каллусной клетки может происходить: 1.вторичная дифференцировка разной степени сложности (морфогенные процессы). В культуре каллусных тканей морфогенезом называют возникновение организованных структур из неорганизованной массы клеток; 2.формирование в клетке состояния стойкой дедифференцировки (привыкание), а следовательно, свойства гормоннезависимости; 3.прохождение цикла развития, с последующим старением и отмиранием.

16 В результате вторичной дифференцировки каллусной клетки могут образоваться: 1.дифференцированные клетки - характеризующиеся определенным строением и выполняющие специфические функции эпибласты – клетки, в которых запасаются вторичные метаболиты 2.ткани: млечники, волокона, трихомы, элементы ксилемы и флоэмы 3.органы 4.из соматических клеток эмбриоидов, биполярные зародышеподобные структуры Все типы дифференцировки обусловлены тотипотентностью Тотипотентность - это свойство любой растительной клетки сохранять генетическую потенцию к восстановлению целого организма. Тотипотентная клетка растений проходит полный цикл клеточных превращений от специализированной клетки растения через каллусную клетку к многообразию форм клеток нового растения. диффернцировка происходит при определенном соотношении фитогормонов и под влиянием генотипа растения-донора, условий и физических факторов культивирования. каллусные клетки - клетки-инициали: образуют утолщенную клеточную стенку, обособление от остальных каллусных клеток, имеют более крупное ядро, много запасных веществ, маленькие вакуоли начинают синтез определенных белков, интенсифицируется пентозофосфатный путь расщепления гексоз, между клетками, формирующими меристематические очаги, восстанавливаются плазмодесмы, (практически отсутствуют в массе каллусных клеток). существует минимальная масса каллусных клеток, которая определяет способность уже детерминированных клеток к дальнейшему морфогенезу.

17 Синтез вторичных метаболитов веществ растений, используются человеком. «+» Сохранение редких и исчезающих видов растений, экологическая чистота сырья, малые площади культивирования, стерильные условия, не зависимость от климатических и погодных факторов, вредителей, болезней, стоимости импортного сырья, приемлемые технологические выходы целевых продуктов, высокая скорость биосинтеза, расширение набора синтезируемых продуктов «-» Проблема химической чистоты, сложность и дороговизна аппаратурного оформления, Например, выход аймалицина и серпентина в культуре клеток Catharantus roseus составляет 1,3 % сухой массы, а в целом растении – 0,26 %. В культуре клеток Dioscorea deltoidea диосгенин синтезируется в количестве 26 мг на 1 г сухой массы, а в клубнях растений - 20 мг на 1 г сухой массы.

18 Факторы, влияющие на синтез вторичных метаболитов: генотип растения-донора - культуры клеток, полученных от высокопродуктивных растений, продуцируют большее число метаболитов. состав питательной среды и концентрация ее компонентов, одновременно определяющий рост биомассы и усиливающий процесс синтеза. –Рост биомассы зависит от природы и количеств углеводов, соединений азота и фосфора, –синтез метаболитов – природа и концентрация фитогормонов.. массоперенос - непрерывное перемешивание с целью обеспечения хорошей аэрации и предотвращения седиментации клеток. ( качалки и биореакторы) Тип культивирования и уровень управляения процессом культивирования на основе показаний датчиков; кроме того, большой объем культивируемого материала позволяет забирать значительные пробы, при этом стрессовые реакции у культуры клеток не возникают. В зависимости от способа перемешивания культуральной жидкости биореакторы делят на две группы эрлифтные и механические. –периодическое культивирование – заключается в том, что по окончании процесса откачивают и используют всю суспензию клеток. –непрерывное (проточное) культивирование – в биореактор постоянно добавляют свежую питательную среду и одновременно отбирают тот же объем либо суспензии (открытое проточное культивирование), либо одной отработанной питательной среды, оставляя клетки в реакторе (закрытое проточное культивирование).

19 открытое культивирование. –турбидостат – измерение и автоматическое поддержание концентрации клеточной биомассы в реакторе на одном уровне путем изменения скорости протока. –хемостат – заключается в подаче в биореактор с постоянной скоростью питательного раствора при одновременном откачивании с той же скоростью клеточной суспензии. иммобилизованные клеточные культуры - носитель с клетками помещают в питательную среду. Клетки остаются живыми. Они прекращают рост, но продолжают синтез метаболитов, выделяя их в среду. Если синтез вторичных метаболитов в суспензионной культуре не доходит до необходимого продукта, то осуществляют биотранформацию (изменение промежуточных метаболитов с помощью культур других растений или клеток бактерий) Биотрансформация оптимальна в бактериальных клетках (редко в растительных). Вводимые в эти культуры вещества могут подвергаться гидроксилированию, эпоксидированию, глюкозилированию, этерификации, а также присоединяться к аминокислотам. Например, культура клеток женьшеня корневого происхождения способна трансформировать (гликозилировать) фенольные соединения – продукты деятельности суспензионной культуры клеток корня Panax ginseng.

20 например – биотрансформация карденолидов Растения наперстянки (Digitalis lanata) в большом количестве синтезируют дигитоксин вместо необходимого дигоксина. Для соответствующей биотрансформации с успехом используют недифференцированную суспензионную культуру наперстянки. Иммобилизованные клетки этой культуры способны долгое время с постоянной скоростью трансформировать β-метилдигитоксин в β- метилдигоксин (А. В. Альферманн и др., 1987). Таким образом, использование суспензионных культур для синтеза вторичных метаболитов в промышленных масштабах имеет большие перспективы, и не только с точки зрения экономической выгоды получения более дешевой продукции в запланированных количествах. Важно, что использование культуры клеток спасет от уничтожения тысячи дикорастущих растений, ставших уже редкими, которые синтезируют необходимые человеку вещества. Увеличение выхода продукта может быть достигнуто благодаря дальнейшей исследовательской работе по селекции специализированных популяций клеток и оптимизации условий культивирования. Большой интерес представляет также дальнейшее развитие методов биотрансформации метаболитов и иммобилизации культивируемых клеток.

21