Строение и транскрипция генов эукариот План 1.Введение. 2.Интроны и экзоны. 3.Транскрипция генов эукариот 4.Регуляция транскрипции у эукариот. - презентация

1 Строение и транскрипция генов эукариот План 1.Введение. 2.Интроны и экзоны. 3.Транскрипция генов эукариот 4.Регуляция транскрипции у эукариот

2 1. Введение В конце 50-х годов ХХ века для гена утвердилось следующее определение: ген – это участок молекулы ДНК, в котором закодирована последовательность аминокислот одного белка. Потом выяснилось, что многие белки (гемоглобин, РНК- полимераза и др.) состоят из нескольких полипептидных цепей. Поэтому определение было модифицировано: ген – это линей- ный участок ДНК, в котором закодирована одна полипеп- тидная цепь молекулы белка. Многие белки закодированы несколькими генами. Считалось, что гены всех организмов устроены так же, как и гены бактерий. Коренные изменения в представлении о строении генов эукариот произошли в конце 70-х годов, в результате развития молекулярно-генетических методов исследований нуклеиновых кислот.

3 2. Интроны и экзоны У эукариот многие гены содержат некодирующие участки ДНК. Такие участки были обнаружены с путём гибридизации одноцепочеченой ДНК отдельных генов с иРНК, выделенной из полисом цитоплазмы. ДНК гена куриного овальбумина была выделена с помощью радиоактивного ДНК-зонда из общей ДНК ядра, разрезанной ферментами рестриктазами. Выделенную ДНК гена клонирова- ли для получения количества, достаточного для исследований. В этой ДНК путём плавления разрывали водородные связи и получали одноцепочечные нити, которые затем гибридизиро- вали с иРНК, выделенной из полисом. Ожидалось, что одноце- почечная ДНК и иРНК, транскрибированная с этого же гена, соединяться друг с другом коплементарно по всей длине. Но был получен иной результат: нить ДНК гена оказалась намного длиннее соответствующей иРНК.

4 На фотографиях, полученных с помощью электронного мик- роскопа, были видны отдельные участки плотно прилегающих ДНК и РНК, а между ними - большие петли, образованные нитью ДНК (рис.1). В ДНК гена овальбумина было 7 таких петель. Когда же провели подобную гибридизацию ДНК и мРНК, выделенной из ядра, то петель не образовалось. Полученные результаты указывают на то, что ДНК гена содержит не только кодирующие участки, но и такие, в которых не закодирован полипептид. Рис Электронная фотография гибрид- ных иРНК и ДНК гена овальбумина; 2 - графическая схема того же изображения.

5 Аналогичные исследования других генов разных эука- риотических организмов показали, что большинство из них имеют такое же мозаичное строение – состоят из чере- дующихся кодирующих и некодирующих участков. Например, структурный ген фактора свёртываемости крови VIII человека, дефект которого вызывает гемофилию, имеет длину 186 тысяч пар нуклеотидов. В его составе имеется 26 экзонов и 27 интронов, причём длина «смысловой» экзонной части составляет всего около 7 тысяч пар (3,8% длины всего гена). У бактерий все исследованные структурные гены состоят только из кодирующей ДНК. Экзоны могут находиться в промоторной и терминаторной частях, т.е. вне структурного гена. Такие экзоны называются некодирующими. Они считываются РНК-полимеразами и остаются в матричной РНК, переходящей из ядра в цитоплазму. В этих РНК-экзонах содержатся участки, необходимые для связывания с рибосомами.

6 3. Транскрипция генов эукариот Транскрипция генов эукариот отличается от тран- скрипции прокариотических генов (рис. 2). В клетках эукариот имеются три различные РНК-полимеразы - А, В и С, которые управляют синтезом соответственно рРНК, мРНК и тРНК. Транскрипция у эукариот про- исходит в ядрах, что приводит к образованию мРНК- предшественников (ядерных мРНК). Роль матриц для трансляции мРНК выполняют только в цитоплазме. При перемещении из ядра в цитоплазму через ядерную мембрану мРНК-предшественники укорачиваются и превращаются в цитоплазматические мРНК. Оба вида мРНК на 5'-концах несут необычное осно- вание - 7-метилгуанозин, соединенное с первым нуклеотидом через связь 5'-5' (рис. 3).

7 Рис. 2. Экспрессия гена эукариот: а принципиальная структура мозаичного гена (1, 3, 7, 9 -некодирующие экзоны; 2, 5, 8 интро- ны; 4,6 кодирующие экзоны; Е энхансер; рпромотор; t терминатор транскрипции); бядерная мРНК (7 мГ - 7-метилгуанозин; А n полиадениловая цепочка из n звеньев) ; в цитоплазматическая мРНК; г - белок-предшественник; д активный белок

8 Кроме того, в мРНК эукариот на 3'-концах находятся полиа- дениловые цепочки, состоящие приблизительно из 200 нуклео- тидов. Синтез этих цепочек обусловлен наличием в 3'-кон- цевых частях мРНК последо- вательности 5'ААУААЗ'. Обе отмеченные особенно- сти мРНК посттранскрипцион- ного происхождения. Разница в длинах ядерной и цитоплазма- тической мРНК является след- ствием процессинга пре-РНК. Рис. 3. 7–метилгуанин (А), соединённый 5'-5'–связью с первым нуклеотидом мРНК (Б)

9 В ходе процессинга из РНК-транскрипта удаляются с помощью специфичных рестриктаз участки, соответствующие интронам; участки, соответствующие экзонам, соединяются друг с другом. Процесс соединения экзонных участков называется сплайсингом. Его механизм до конца неизвестен. Экзоны в цитоплазма-тической мРНК объединяются в результате сплайсинга так, что в сохраняется правильная последовательность кодонов. Это до- стигается благодаря наличию на 5'- и 3'-концах интронов спе-цифических последовательностей нуклеотидов. Эти последовательности высококонсервативны для генов любого происхожде- ния - все интроны на 5'-концах несут ГУ нуклеотиды, а на 3'-концах - АГ нуклеотиды.

10 Точность сплайсинга зависит и от видоспецифических последовательностей нуклеотидов, расположенных в интронах на расстоянии п.н. от 3'-концов. В генах человека, мыши, крысы это последовательность 5'ЦТГАЦЗ', дрозофилы - 5'ЦТААТ3', дрожжей - 5'ТАЦТААЦ3'. Эти последовательно- сти определяют выбор динуклеотида АГ на 3'-конце интрона. Если динуклеотид АГ удалить, то сплайсинг происходит по следующему такому же динуклеотиду. Сайт связывания рибосом у эукариотической мРНК не имеет фиксированной химической структуры, но активную роль в нем играет 7-метилгуанозин (рис. 3). При экспериментах in vitro обнаружено, что присоединение этого необычного нуклеотида к 5'-концу прокариотических мРНК обеспечивает их трансляцию с помощью эукариотических рибосом.

11 4. Регуляция транскрипции у эукариот Гены эукариот не группируются в опероны, поэтому каждый ген имеет собственные промотор и терминатор. В эукариотических промоторах различают ГЦ и AT богатые области. Первая располагается на участке с координатами и служит, вероятно, для первичного контакта РНК- полимеразы В с промотором. Вторая находится на отметке около -30 и служит для точной ориентации РНК-полимеразы относительно первого транскрибируемого нуклеотида. Вторая область имеет характерную последовательность нуклеотидов 5'ТАТА(А/Т)А(Т/А)3. Наличие в ней АТ-пар облегчает плавление ДНК, необходимое для инициации транскрипции. В первой области и в других частях промоторов консервативные последовательности нуклеотидов отсутствуют.

12 Это объясняется тем, что у эукариотических генов функции регуляторных участков зависят не от порядка нуклеотидов в цепи, а от коллективных физических свойств пар нуклеотидов, составляющих эти участки. Для промоторов одним из таких свойств является, по-видимому, профиль их стабильности, т.е. характерное распределение ГЦ- и АТ-пар вдоль промоторов при случайном порядке пуринов и пиримидинов. С промоторами эукариотических генов функционально связаны их специфические локусы энхансеры (enhancer усилитель) и регуляторные элементы. Энхансер увеличивает число посадок РНК-полимеразы на промотор ближайшего гена в десятки и сотни раз. Энхансер может находиться в любой ориентации по отношению к гену, располагаться с любой его стороны, внутри него (в интроне) и даже на расстоянии в несколько тысяч пар нуклеотидов. Данные свойства энхансера проявляются лишь в определенных тканях, т.е. энхансеры тканеспецифичны.

13 Энхансеры способгы действовать и на "чужие" гены. Напри- мер, энхансер вируса SV40, располагаясь слева или справа от него на расстоянии до 3 т.п.н., увеличивает эффективность транскрипции гена β-глобина кролика в 200 раз. Регуляторные элементы присутствуют у так называемых индуцибельных генов (гены интерферонов, металлотионеина и др.), транскрибирующихся только при поступлении в клетку определенных биохимических веществ. В отличие от энхансе- ров, они тесно сцеплены с промоторами и располагаются непо- средственно слева от них, или перекрываются с ними. Таким образом, механизм регуляции транскрипции у эукари- от гораздо более гибкий, чем у прокариот.

14 Фиксированная химическая структура прокариотических про- моторов обусловливает регуляцию только по принципу "все или ничего", в то время как коллективные физические свойства эукариотических промоторов совместно со свойствами энхан- серов или регуляторных элементов позволяют осуществлять нюансированную регуляцию от полной экспрессии до полной репрессии, что достигается путем локальной моди- фикации ДНК, изменением внутриклеточных условий и т.д. В терминаторах транскрипции генов эукариот, как и в про- моторах, имеются две характерные области. На расстоянии приблизительно 100 п.н. до сайта, где обрывается транскрип- ция, располагается последовательность, состоящая из 3040 тимидиновых остатков. Ее роль, по-видимому, заключается.в торможении движения РНК-полимеразы по ДНК в конце гена. На расстоянии.около 20 п.н. до указанного сайга находится последовательность 5'ААТАА3'. Участие ее в терминации транскрипции не доказано, но выяснено, что она определяет полиаденилирование мРНК на 3'-конце транскрипта.

15 Вопросы и задания 1.1. Опишите эксперимент, в котором было впервые обнаружено мозаичное строение генов эукариот Нарисуйте схему транскрипции гена эукариот Чем некодирующие экзоны отличаются от интронов? 4.4. Какое значение в мРНК играет 7-метилгуанозин? 5.5. Выпишите названия и определения регуляторных элементов генов эукариот. 6. Что такое процессинг и сплайсинг? Где происходят эти процессы?