ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПЦР В КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ Цаур Г.А Центр детской онкологии и гематологии Областная детская клиническая больница 1 Екатеринбург. - презентация

1 ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПЦР В КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ Цаур Г.А Центр детской онкологии и гематологии Областная детская клиническая больница 1 Екатеринбург

2 Молекулярно-генетические методы Полимеразная цепная реакция (PCR) Методика разветвленных зондов (branched DNA) Транскрипционно-опосредованная амплификация Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) Амплификация с вытеснением цепи (SDA) Гибридный захват (HC) Лигазная цепная реакция (LCR) Другие... QB репликаза, Биочипы

3 Молекулярно-генетические методы Ломают границы между традиционными лабораторными технологиями Клиническая химия Гематология Микробиология Вирусология Генетика

4 Kary B. Mullis Saiki R, Scharf S., Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science Dec 20;230(4732):

5 Схема ПЦР

6 ПЦР в реальном времени метка гаситель праймер матрица полимераза флуоресценция полимераза А.В.Мисюрин

7 ПЦР в реальном времени Пороговое значение Пороговый цикл

8 10 7 копий 10 5 копий 10 6 копий

9 Сравнение результатов ПЦР и ПЦР в реальном времени

10 ПЦР в реальном времени HCV Количество геномных эквивалентов / мл Качественное определение HCV

11 Преимущества ПЦР в реальном времени 1. Повышение специфичности метода за счет наличия зонда ; 2. Возможность количественного определения; 3. Автоматизация; 4. Снижение риска контаминации за счет отсутствия электрофореза ; 5. Снижение времени проведения реакции; 6. Уменьшение площади, занимаемой ПЦР- лабораторией

12 Относительно просты в исполнении Зачем использовать ПЦР? Высокая чувствительность Быстрее по сравнению с традиционными генетическими и микробиологическими методами Не существует альтернативных методов диагностики Эффективны для мониторинга эффективности лечения

13 Относительно просты в исполнении требует высокой квалификации персонала Оборотная сторона Высокая чувствительность существует потенциальная опасность ложно+ результатов (контаминации) Быстрее по сравнению с традиционными генетическими и микробиологическими методами но часто необходимы дополнительные методы верификации Не существует альтернативных методов диагностики Эффективны для мониторинга эффективности лечения

14 Направления применения ПЦР Инфекционная микробиология / Санитарная эпидемиология Диагностика и мониторинг терапии онкологических и онкогематологических заболеваний Наследственные заболевания Тестирование на наличие генетически- модифицированных компонентов в продуктах питания Фармакогеномика HLA-типирование

15 Революция в диагностике инфекционных заболевания Быстрое и точное определение возбудителей бактериальных и вирусных инфекций, в т.ч.некультивируемых и медленно растущих Терапевтический мониторинг эффективности лечения при вирусных заболеваниях Определение устойчивости к антибиотикам Открытие и идентификация новых вирусов Эпидемиологические исследования (особенно для социально значимых инфекций) Выработка стратегии по контролю инфекционных заболеваний

16 Молекулярная микробиология HIV-1 & 2 HCV HBV EBV CMV HSV 1, 2, 6 типов VZV HPV JC & BK вирусы Энтеровирусы Риновирус Аденовирус РС-вирус Метапневмовирус Вирус Лихорадки Западного Нила Вирус гриппа Вирусы парагриппа SARS Парвовирус B19 HAV Toxoplasma Legionella Chlamydia N. Gonorrhoeae Mycobacterium spp. Mycoplasma & Ureaplasma Bordetella Helicobacter pylori MRSA Candida И другие

17 Острый лимфобластный лейкоз T-ALLPro-B Pre-B / common Pre-BB-ALL Del 1p32 SIL / TAL t(4;11) MLL / AF4 t(9;22) BCR / ABL t(11;19) MLL / ENL t(8;14) MYC / IgH t(12;21) TEL / AML1 t(1;19) E2A / PBX СОЗРЕВАНИЕ B-клеток

18 Острый миелобластный лейкоз ОМЛ М2ОМЛ M3ОМЛ М4ОМЛ M5ОМЛ М7 t(8;21) AML / ETO t(15;17) PML / RARa inv16 CBFb / MYH11 t(1;22) t(9;11) MLL / AF9 WT-1, NPM1, FLT3

19 Солидные опухоли ГенЗаболевание RB1Ретинобластома MYCNНейробластома CDKN2AМеланома ATMАтаксия-телеангиэктазия BRCA Наследственные форма рака молочной железы APCНаследственный полипоз кишечника

20 Факторы прогноза ГенЗаболеваниеПрогноз BCR / ABLОЛЛ TEL / AMLОЛЛ PML / RARaОМЛ М3 MYCNНейробластома SPARCМенингиома

21 Оценка эффективности терапии(МРБ) ГенЗаболевание IgHОЛЛ TCRОЛЛ Ген тирозингидролазыНейробластома СК19Рак молочной железы СК20Рак желудка Ген кодирующий PSAРак простаты FLI1 / EWSСаркома Юинга

22 Мониторинг количества химерного гена MLL-AF4 (МРБ) Пациент A.K., КМПациент А.Г, КМ Динамика снижения MLL - AF4 в костном мозге и периферической крови Стандартная кривая для плазмиды MLL - AF 4 Slope Y-Intercept

23 Клонирование генов создание трансгенных животных, генетически модифицированных растений (1) ДНК организма А, упакованная в хромосомы. (2) ПЦР. (3) Множество копий 1 гена из организма A. (4) Вставка гена в плазмиду. (5) Плазмида со встроенным геном из организма А. (6) Вставка плазмиды в организм B. (7) Увеличение числа копий гена организма А в организме B.

24 Тестирование на наличие генетически- модифицированных ингредиентов Соя линия Кукуруза линия GA-21 (терминатор Nos) линия MON 810

25 Наследственные заболевания Муковисцидоз - 7 мажорных мутаций гена CFTR ( F508, G17173A, G542X, R553X, 3905 insertion T, W1282X, N1303K) Миодистрофия Дюшенна Гемофилия А и В - более 100 мутаций Болезнь Вильсона-Коновалова - 70 мутаций в гене БВК, наиболее часто His1069Gln Гемохроматоз ( C282Y, H63D )

26 Направления применения ПЦР Идентификация личности (+отцовство) «геномная дактилоскопия» Исследование эволюционной теории Электрофорез амплифицированных в ходе ПЦР фрагментов ДНК (1)Отец. (2) Ребенок. (3) Мать. У ребенка есть часть генов от каждого из родителей. И это дает новую уникальную комбинацию

27 Геномная дактилоскопия

28 Фармакогеномика Субстраты для CYP2D6 и CYP2C19

29 Фармакогеномика для индивидуализирования терапии Высокий риск токсических эффектов Предположительно, ответят на терапию Лечение альтернативными дозами препаратов Предположи тельно, не ответят на терапию Лечение обычными дозами препаратов

30 1.Подбор пары донор-реципиент при трансплантации 2.Определение предрасположенности к заболеваниям: -Сахарный диабет I типа -Целиакия -Анкилозирующий спондилоартрит -Ревматоидный артрит HLA-типирование H uman L eukocyte A ntigens HLA-антиген II класса HLA-антиген I класса

31 HLA-типирование ПЦР-SSP ПЦР-SSO Секвенирующее типирование

32 HLA-типирование. ПЦР-SSP

33 Совместимость по системе HLA для ТГСК ЛокусРекомендации HLA-A Да HLA-B Да HLA-C Да HLA-DRB1 Да DRB3, 4 и 5 Не известно HLA-DQA1 и B1 Не ясно HLA-DPA1 и B1 Не ясно National Marrow Donor Program, NMDP USA (2004)

34 Принцип подбора доноров: отличия HLA-типирования «низкого» и «высокого» разрешения J.M. Tiercy, Prague, 2007

35 Контроль качества Преаналитический этап ПроцедураУсловия Взятие образцаВ закрытые системы, свободные от ДНКаз, РНКаз Транспортировка Максимально быстро. Оптимально при +4 С Хранение Для исследования РНК – С. Не допускать повторное замораживание не допустимо В.В. Меньшиков Клиническая лабораторная диагностика, 2006, 3

36 Оценка качества РНК Свежий материал RIN 8.3 Хранение 1 день, комнатная температура Транспортировка 2 дня, комнатная температура Транспортировка 4 дня, комнатная температура

37 Чувствительность метода Теоретическая Реальная (на примере MLL-AF4 протокол EAC) Костный мозг 5*10 -4 – 6*10 -5 Кровь 1*10 -4 – 7*10 -4

38 Различия в стандартах Slope Y-Intercept Slope Y-Intercept Плазмиды b2m Ipsogen копий копий Плазмиды b2m другой производитель

39 Программа контроля качества EQUAL Одинаковые праймеры и зонды Одинаковые разведения стандартной кДНК Одинаковые образцы крови с неизвестной концентрацией Разная химия (полимераза, обратная транскрипция для неизвестных образцов) Разные приборы для ПЦР в реальном времени

40 Ramsden et al.:Clinical Chemistry 52, No. 8, кДНК 5,526 *10 1 копий гена ABL min 2,569*10 1 max 541,170*10 1

41 Ramsden et al.:Clinical Chemistry 52, No. 8, 2006 Образец крови с неизвестным количеством копий гена ABL Min 0,180*10 4 mean 5,632*10 4 max 21,284*

42 Программа контроля качества GLEEM T. Zhang et al Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 9, No. 4, September 2007 К562 – клеточная линия, несущая химерный ген BCR / ABL, характерный для ХМЛ

43 Обязательно типировать образцы в повторах (в идеале в триплетах), особенно при низкой концентрации исследуемого гена-мишени T. Zhang et al Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 9, No. 4, September 2007

44 Воспроизводимость по гену b2m. Образцы от пациентов с неизвестной концентрацией Число копий Образцы пациентов, протестированные в 5 разных постановках в триплетах 1234 Mean 35,7* ,2*10 5 8,3*10 5 0,8*10 5 SD 7,1*10 5 1,1*10 5 1,4*10 5 0,3*10 5 CV, % 20,007,4117,0240,53

45 Воспроизводимость Ct b2m Концентрация плазмид Ct 1,00E+071,00E+061,00E+05 Mean 14,1517,4820,73 SD 0,510,670,62 CV, % 2,513,471,75

46 Различия в приборном парке Амплификация

47 Различия в приборном парке M Silvy et al Leukemia (2005) 19, 305–307

48 Благодарю за внимание!