Современные подходы к скринингу дифференциального метилирования геномов клеток рака молочной железы Виктория Шкарупо Лаборатория Молекулярной генетики. - презентация

1 Современные подходы к скринингу дифференциального метилирования геномов клеток рака молочной железы Виктория Шкарупо Лаборатория Молекулярной генетики человека НИЦ Молекулярной медицины ММА им.И.М.Сеченова

2 Технологические преимущества определения маркеров метилирования перед детекцией мутаций/делеций ДНК Нарушения метилирования ДНК – один из наиболее ранних процессов канцерогенеза Частоты аномального метилирования множества генов значительно превышают частоты структурных повреждений тех же генов при канцерогенезе Выявление аномально метилированных молекул ДНК в избытке нормального биологического материала не вызывает проблем, детекция же мутаций/делеций в этой ситуации практически невозможна Анализ метилирования одного гена технически прост и в большинстве случаев сводится к ПЦР с одной-тремя парами праймеров. Поиск же мутаций в одном гене требует использования до нескольких десятков пар праймеров, кроме того, удовлетворительная эффективность достигается только после секвенирования фрагментов ПЦР.

3 Технологические преимущества маркеров метилирования ДНК перед детекцией маркеров экспрессии на уровне РНК Стабильность ДНК значительно выше Аномально метилированную ДНК можно детектировать в плазме крови и других биологических жидкостях (неинвазивные / низкоинвазивные тесты) Аномальное метилирование – качественный, а не количественный признак, поэтому на достоверность его определения не влияет присутствие молекул нуклеиновых кислот из нормальных тканей

4 Масштабный скрининг метилирования ДНК Высокая чувствительность молекулярно-генетических маркеров канцерогенеза может достигаться на уровне единичных маркеров Удовлетворительная специфичность молекулярно- генетических маркеров канцерогенеза достигается только при использовании систем десятков маркеров Современные подходы к масштабному скринингу метилирования Полногеномное секвенирование метилома Скрининг дифференциального метилирования геномов

5 Цель: разработка современного высокотехнологичного скрининга дифференциального метилирования ДНК Анализ ранее опубликованных подходов; выбор и обоснование методической базы исследования Разработка лабораторного протокола метода скрининга дифференциального метилирования ДНК Разработка методов картирования выявляемых дифференциально метилированных локусов Проведение скрининга дифференциального метилирования геномов клеток рака молочной железы (РМЖ); характеристика нормальных и опухолевых метилотипов Картирование и характеристика частот аномального метилирования конкретных выявленных локусов при РМЖ Задачи:

6 Метод амплификации интерметилированных сайтов ( АИМС ) Frigola et al., 2002

7 Компьютерная программа PeakPick: анализ и сравнение реальных электрофореграмм

8 Позиционирование продуктов АИМС на капиллярной электрофореграмме 1. Секвенирование индивидуальных фрагментов 2. Рестрикционное картирование на основании анализа AIMS in silico

9 Полная репрезентация АИМС in vitro - CpG-метилаза M.SssI - XmaI АИМС

10 Позиционирование продуктов АИМС на капиллярной электрофореграмме Рестрикционное картирование на основании анализа AIMS in silico C2CD2-5-CpG Межгенный13q32.1-CpG PHF-5-CpG 12q CpG неохарактеризованные сплайсируемые РНК Рестриктаза NotI - C2CD2-5-CpG Рестриктаза AscI - PHF-5-CpG Рестриктаза GsaI - межгенный CpG-островок 13q32.1 Рестриктаза AvrII - 12q CpG

11 Скрининг дифференциального метилирования: нормальные и опухолевые метилотипы интронный-CpG- островок CUX1 ZBTB4-3-CpG Х-сцепленный IQSEC2 – 5-CpG C12orf32- 5-CpG FOXM1-5-CpG ANK3- 5-CpG

12 В каждом из образцов опухолевых тканей показано аномальное метилирование по крайней мере одного из 30 проанализированных CpG-островков. Ген (локус)Частота метилирования при РМЖ, % Частота метилирования в условно нормальных образцах молочной железы, % Наличие метилирования в клетках Jurkat ANK300+ ATP2B EST CN C2CD230+ AX AK TMEM176A120- TMEM176B100- FOXM170- C12orf3220- KIAA1324L100- ITGA970- Межгенный CpG-островок (13q32.1) 80-

13 Клинико-генетические ассоциации

14

15 Поиск и характеристика дифференциально метилированных промоторных и др. CpG- островков Характеристика особенностей метилирования различных структурно-функциональных элементов генома Скрининг аномального метилирования в диагностике, в т.ч. ранней. Области применения

16 Благодарности Стрельников Владимир Викторович, к.б.н., в.н.с. Танас Александр Сергеевич, н.с. Кузнецова Екатерина Борисовна, к.б.н, ст.н.с. Спасибо за внимание !

17 Определение метилирования одного локуса методом метилчувствительной ПЦР М – маркер молекулярной массы ДНК О – отрицательный контроль ПЦР (H 2 O) П – положительный контроль ПЦР (ДНК) о – гидролизованная ДНК из тканей опухолей н - гидролизованная ДНК из прилежащих нормальных тканей

18 Определение метилирования методом мультилокусной метилчувствительной ПЦР N33, CD44, GSTP, RASSF1, GPX3, SFRP – анализируемые гены НВВ – внутренний контроль ПЦР

19 Полная репрезентация АИМС in vitro и in silico

20 Анализ метилирования ДНК из клеток линии Jurkat, культивированных в присутствии 5-Aza-dc

21 Области приложения разработанного программного обеспечения Дизайн и анализ результатов экспериментов: - АИМС - амплификации неметилированных Alu- повторов - количественного анализа совокупного геномного метилирования Alu-повторов - детекции экстраметилированных сайтов - детекции экстранеметилированных сайтов Анализ результатов фрагментного анализа

22 Дизайн эксперимента с помощью программы AIMS in silico рестриктаз удлинителей праймеров, дискриминирующих различные геномные элементы, например, CpG-островки или рассеянные повторы. удлинителей праймеров, ограничивающих количество ожидаемых продуктов АИМС до значений, приемлемых при анализе капиллярным электрофорезом. Выбор:

23 Дифференциально метилированный участок интрона 1 гена ATP2B4 расположен в окне открытого хроматина.