ИММУНОФЕНОТИПИРОВАНИЕ СУБПОПУЛЯЦИИ ЛИМФОЦИТОВ CD4 ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ Модуль 7. Уровни CD4 как иммунологический клинический маркер для мониторинга ВИЧ-инфекции. - презентация

1 ИММУНОФЕНОТИПИРОВАНИЕ СУБПОПУЛЯЦИИ ЛИМФОЦИТОВ CD4 ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ Модуль 7. Уровни CD4 как иммунологический клинический маркер для мониторинга ВИЧ-инфекции

2 Задачи В конце данного модуля вы сможете: дать определение CD4 и роли клеток CD4 в работе иммунной системы; описать практическую значимость подсчета количества клеток CD4 для планирования и мониторинга процесса лечения.

3 Задачи В конце данного модуля вы сможете: описать влияние антиретровирусной терапии на мониторинг; оценить, имеются ли соответствующие данные для определения референс-диапазона для взрослых и детей в вашей региональной популяции.

4 Программа на сегодня Иммунная система – Гемопоэз – Субпопуляции лимфоцитов – Общие CD-маркеры и CD4 CD4 и ВИЧ-инфекция Референс-диапазоны CD4 Научные исследования Резюме

5 Введение в иммунную систему Защита организма: два уровня Врожденный иммунитет – Неспецифический – Первая линия защиты – Воспаление – Повторное воздействие без нарастания

6 Введение в иммунную систему Защита организма: два уровня Приобретенный иммунитет – Специфический – Вторая линия защиты – Повторное воздействие нарастание память

7 Врожденный иммунитет Реснитчатый эпителий: трахея Лизоцимы Слизь Сальные железы Кожа Кислота в желудке Симбионтные микроорганизмы в кишечнике и влагалище Спермин в семенной жидкости Компоненты – Биохимические Ферменты, комплемент и т. п. Секреция pH – Физические Кожа Реснитчатый эпителий – Клетки Фагоциты, естественные киллеры (NK)

8 Взаимодействие приобретенного и врожденного иммунитета Инфекционное воздействие Врожденный иммунитет предотвращает Врожденный иммунитет не срабатывает Система приобретенного иммунитета Выздоровление Второе инфекционное воздействие тот же микроорганизм Приобретенный иммунитет Специфическая память Отсутствие заболевания Заболевание

9 Система врожденного иммунитета Компоненты – Биохимические Ферменты, комплемент и т. п. Секреция pH – Физические Кожа Реснитчатый эпителий – Клетки Фагоциты, естественные киллеры (NK)

10 Приобретенный/антиген- специфический иммунитет Гуморальный иммунитет – Опосредованный антителами (белками), которые атакуют чужеродные вещества. Клеточный иммунитет – Опосредованный клетками (Т-лимфоцитами), которые напрямую атакуют чужеродные вещества.

11 Лимфоциты Эти клетки происходят из клетки- предшественницы в костном мозге. Дифференцировка и созревание происходит в костном мозге (B-клетки) и вилочковой железе (T-клетки). В процессе созревания они начинают экспрессировать рецепторы антигенов и становятся способными реагировать на антигенную стимуляцию.

12 Развитие лимфоцитов На данной схеме показаны различные типы клеток крови. T-клетки являются субпопуляцией лимфоцитов, развивающейся в вилочковой железе. Клетки T-хелперы являются субпопуляцией T-лимфоцитов. Общий предшественник лимфоцитов Плюрипотентная стволовая клетка Миелоидный предшественник Предшественник T-клетки Предшественник B-клетки Мегакариоцит Эритробласт Нейтрофил Эозинофил Эритроцит БазофилМоноцит Тромбоциты B-клетка Естественный киллер (NK-клетка) Вилочковая железа (тимус) Естественный киллер (NK-клетка) B-клеткаT-клетка Моноцит Базофил Макрофаг Тучная клетка Ткани T-зависимые зоны лимфатических узлов и селезенки B-клеточные зоны лимфатических узлов, селезенки, пейеровых бляшек и миндалин

13 B-лимфоциты Эти клетки являются производными стволовых клеток и созревают в костном мозге. B-клетки продуцируют антитела. Антитела (иммуноглобулины) могут секретироваться B-клеткой или оставаться связанными с поверхностью В-клетки.

14 T-лимфоциты Предшественники зарождаются в костном мозге, мигрируют в вилочковую железу и созревают в ней. В дальнейшем они подразделяются: – на клетки T-хелперы; – цитотоксические T-клетки. Рецептор антигена на T-лимфоцитах является рецептором T-клетки (TcR), по структуре родственным антителам.

15 Клетки T-хелперы Секретируют низкомолекулярные белки (цитокины) в ответ на антигенную стимуляцию. Эти цитокины являются сигналом для Т-клеток, В-клеток и макрофагов к началу или к поддержанию иммунного ответа. Иммунный ответ направлен на противоборство с инфекционным микроорганизмом и его уничтожение.

16 Взаимодействие T- и B-клеток

17 CD4 на клетках T-хелперах Клетки T-хелперы имеют на своей поверхности белок, называемый CD4. Белок gp120 на поверхности ВИЧ связывается с этим белком CD4, таким образом происходит инфицирование T-хелперов.

18 CD4 на клетках T-хелперах При повышении степени тяжести ВИЧ-инфекции количество клеток, экспрессирующих CD4, будет падать. Таким образом, знание количества клеток CD4 у ВИЧ-инфицированного лица позволяет оценить степень тяжести заболевания.

19 Прикрепление gp120 на ВИЧ к CD4 и рецептору хемокина на клетке Т-хелпере Глико- протеин gp120

20 Цитотоксические T-клетки Субпопуляция Т-клеток. Эти клетки способны разрушать клетку- мишень, содержащую инфекционный микроорганизм, например вирус. Цитотоксические T-клетки имеют на своей поверхности белок, называемый CD8.

21 Цитотоксичность CD8 T-клетки

22 Как различить лимфоциты Лимфоциты несут на своей поверхности белки, связанные с функцией клетки. – Например, CD4 на клетках T-хелперах или CD8 на цитотоксических T-клетках. В лабораторных условиях можно идентифицировать эти белки и таким образом определить количество лимфоцитов каждого типа. Термином CD обозначается унифицированная номенклатура, принятая для идентификации этих белков.

23 Что означает CD? CD означает «кластер дифференцировки», относящийся к белкам поверхности клетки. Эти белки часто связаны с клеточной функцией; клетки с различными функциями экспрессируют различные молекулы CD. Описано более 300 молекул CD.

24 CD4 Белок CD4 обнаруживается на поверхности клеток различных типов, включая клетки T-хелперы. Этот белок также связывается с молекулой gp120, которая экспрессируется на внешней поверхности ВИЧ. – Это связывание является первым контактом между ВИЧ и его клеткой-мишенью. – Для ВИЧ-инфицирования клетки также необходимы другие молекулы, известные как рецепторы хемокинов.

25 Прикрепление gp120 на ВИЧ к CD4 и рецептору хемокина на клетке Т-хелпере Глико- протеин gp120

26 Молекулы СD, используемые для идентификации различных подклассов лимфоцитов CD45Все лейкоциты CD3T-клетки CD4Клетки T-хелперы CD8Цитотоксические T-клетки CD19B-клетки CD56Клетки естественные киллеры (NK)

27 Вопросы?

28 Программа на сегодня Иммунная система – Гемопоэз – Подклассы лимфоцитов – Общие CD-маркеры и CD4 CD4 и ВИЧ-инфекция Референс-диапазоны CD4 Научные исследования Резюме

29 Связывание ВИЧ с CD4 и рецептором хемокина

30 CD4 на клетках T-хелперах Клетки T-хелперы необходимы для надлежащего функционирования системы приобретенного (антиген-специфичного) иммунитета. ВИЧ угнетает иммунный ответ, инфицируя и разрушая CD4-положительные клетки T-хелперы. – Таким образом, количество CD4-положительных T-клеток в периферической крови позволяет оценить степень иммуносупрессии, вызванной ВИЧ.

31 Показатель количества клеток CD4 не является основанием для диагноза ВИЧ-инфекции. Количество СD4-положительных T-клеток может снижаться и при других вирусных инфекциях или состояниях иммунодефицита, не связанных с ВИЧ. Показатель количества CD4-положительных T-клеток может быть использован для оценки стадии заболевания или для мониторинга снижения иммунитета у лиц с ВИЧ-инфекцией, подтвержденной исследованиями по определению антител, антигена и (или) нуклеиновых кислот.

32 Клиническая значимость мониторинга клеток CD4 Центры по контролю за заболеваниями США и ВОЗ включают определение уровня CD4-положительных T-клеток в оценку стадии ВИЧ-инфекции. Определение количества CD4-положительных T-клеток используется также при начале АРТ и лечении связанных с ВИЧ заболеваний. – Показатель количества CD4 T-клеток может быть использован как индикатор эффективности антиретровирусной терапии.

33 Клиническая значимость мониторинга клеток CD4 Абсолютное количество CD4-положительных T-клеток выражается в клетках на микролитр (клеток/мкл). – Врачи также используют данные о доле T-лимфоцитов, экспрессирующих CD4, особенно в детской популяции ВИЧ-инфицированных.

34 Запомните Несмотря на то что показатель количества CD4-положительных T-клеток является критическим инструментом мониторинга ВИЧ-инфекции, снижение количества CD4-положительных T-клеток само по себе не является диагностическим показателем наличия ВИЧ-инфекции.

35 Запомните Основными методами лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции являются серологические, вестерн-блот анализы и обнаружение ДНК/РНК. Существуют другие состояния первичного иммунодефицита, приводящие к пониженным значениям количества клеток Т-хелперов. При этих состояниях не наблюдается прогрессирующее во времени снижение количества клеток CD4, как это имеет место при ВИЧ-инфекции.

36 CD4 T-клетки и ВИЧ Снижение количества CD4-положительных T-клеток связано с повышенным риском развития оппортунистических инфекций и прогрессирования ВИЧ-инфекции. – Снижение количества клеток СD4 до менее 200/мкл сопровождается более высоким риском развития пневмоцистозов. – Значения CD4 менее 100/мкл ассоциируются с более высоким риском развития микобактериальных инфекций. Показатель количества CD4-положительных T-клеток используется для клинического прогнозирования, мониторинга ответа на лечение в качестве критерия включения в антиретровирусную терапию.

37 Динамика снижения количества CD4-положительных T-клеток ВИЧ-инфекция развивается в СПИД у различных пациентов с разной скоростью. Динамика снижения количества CD4-положительных T-клеток может быть использована в качестве вспомогательного показателя при мониторинге пациентов для определения, являются ли они «быстро прогрессирующими», «длительно непрогрессирующими» или «обычными непрогрессирующими».

38 Клинические последствия ВИЧ- инфекции (быстро прогрессирующие) 26 недель В среднем 5 лет между инфицированием и диагнозом СПИД Бессимптомная фаза Гриппо- подобное заболевание (характерно не для всех пациентов) Фаза с наличием симптомов СПИД CD4 T-клеток/мкл Инфекция Сероконверсия Смерть Снижение количества CD4 T-клеток Высокоактивная антиретровирусная терапия (HAART)

39 Клинические последствия ВИЧ- инфекции (медленно прогрессирующие) 26 недельВ среднем 20 лет Бессимптомная фаза Гриппо- подобное заболевание (характерно не для всех пациентов) СФ Инфекция Сероконверсия Снижение количества CD4 T-клеток СПИДСПИД Смерть Высокоактивная антиретровирусная терапия (HAART) CD4 T-клеток/мкл

40 Вопросы?

41 Программа на сегодня CD4 – Определение – Подклассы лимфоцитов – Гемопоэз CD4 и ВИЧ-инфекция Референс-диапазоны CD4 Научные исследования Резюме

42 Изменение лимфоцитарного состава крови с возрастом У новорожденных и детей раннего возраста абсолютное количество лимфоцитов, а также абсолютное количество CD4-положительных T-клеток выше, чем у взрослых. В целом абсолютное количество лимфоцитов каждого подкласса снижается с возрастом.

43 В противоположность абсолютным показателям процентное соотношение субпопуляций лимфоцитов и соотношение CD4:CD8 остаются практически постоянными для всех возрастных групп. Мировая практика свидетельствует, что при ведении пациентов детского возраста врачи используют показатели процентного содержания CD4- положительных T-клеток, а для взрослых пациентов измеряют абсолютное количество CD4 T-клеток. Изменение лимфоцитарного состава крови с возрастом

44 Референс-значения количества CD4 T-клеток Уровень CD4-положительных T-клеток наиболее широко используемый маркер при мониторинге иммунного статуса ВИЧ-инфицированных лиц. На показатель количества CD4-положительных T-клеток у лиц, серонегативных по ВИЧ, оказывают влияние возраст, расовая принадлежность, регион проживания, пол, время взятия пробы крови и физическая нагрузка.

45 Референс-значения количества CD4 T-клеток Предположительно, различие, наблюдаемое между разными популяциями, обусловлено как генетическими особенностями, так и факторами окружающей среды, хотя однозначные причины таких различий не выявлены. Такая изменчивость показателей указывает на необходимость установления или проверки в лабораторных условиях референс-диапазонов содержания подклассов лимфоцитов у местной популяции здоровых лиц.

46 Лаборатории, определяющие CD4- положительные T-клетки, должны определить соответствующие референс-диапазоны для популяций, которые они обслуживают. – Имеются публикации исследований референс- значений субпопуляций лимфоцитов в различных географических регионах. Референс-значения количества CD4 T-клеток

47 Определение референс- диапазонов СD4 Определение количества CD4-положительных T-клеток следует проводить в большой выборке здоровых лиц, репрезентативной по возрасту и полу относительно обслуживаемой популяции. Диапазон, включающий 95 % значений, определенных у здоровых лиц, будет являться референс-диапазоном для данной популяции.

48 Протокол определения референс-диапазонов показателя CD4 T-клеток у взрослых Исследуемая популяция – Нормальные здоровые взрослые доноры (1865 лет), не получающие лекарственной терапии по поводу клинически выраженного заболевания. – Если в вашем регионе реализуется программа донорства крови, для определения референс- диапазонов можно использовать образцы от здоровых доноров крови.

49 Протокол анализа – Референс-диапазон следует определять, используя тот же инструмент, который будет использоваться при проведении анализа у пациентов. – Определите референс-диапазоны для всех подклассов лимфоцитов, которые могут использоваться в реализуемой программе мониторинга ВИЧ. В некоторых регионах или некоторыми врачами при мониторинге пациентов также используется значение CD8. Протокол определения референс-диапазонов показателя CD4 T-клеток у взрослых

50 Определение референс- диапазонов СD4 у детей В определенной местности в связи с отсутствием возможности проведения анализа у достаточного количества здоровых детей установление референс-диапазонов для детей бывает невозможным. – В случае отсутствия возможности местного определения диапазонов в качестве руководства могут быть использованы опубликованные референс-диапазоны. Перечень публикаций приведен в приложении. – Опубликованные диапазоны должны быть проверены путем проведения анализа у небольшого количества местных добровольцев.

51 Суточные изменения содержания клеток CD4 Уровни СD4-положительных T-клеток (и общего количества лимфоцитов) имеют тенденцию к повышению в период бодрствования (08:0022:00). – Эти повышения могут достигать 60 CD4-положительных T-клеток/мкл у ВИЧ-инфицированных пациентов и сотен клеток/мкл у здоровых лиц контрольной группы. Таким образом, для минимизации влияния указанных суточных колебаний при мониторинге все образцы следует отбирать приблизительно в одно и то же время суток.

52 Вопросы?

53 Программа на сегодня CD4 – Определение – Подклассы лимфоцитов – Гемопоэз CD4 и ВИЧ-инфекция Референс-диапазоны CD4 Научные исследования Резюме

54 Практикум 1: разбор случая (пациент с ВИЧ-инфекцией) Значения показателя количества клеток СD4 у пациен- тов с ВИЧ-инфекцией измеряют периодически в целях мониторинга иммунного статуса пациента. Значение абсолютного количества клеток CD4 у ВИЧ-инфицированного пациента составляет 75/мкл по состоянию на 1 апреля. По состоянию на 1 июля абсолютное количество клеток CD4 составляет 110/мкл. Апрельский образец был взят в 09:00. Июльский образец был взят в 16:30. Вопрос. Следует ли рассматривать такой результат как значимое увеличение абсолютного количества клеток СD4? Будьте готовы объяснить ваш ответ.

55 Разбор практикума 1: разбор случая (пациент с ВИЧ-инфекцией) Вопрос. Следует ли рассматривать такой результат как значимое увеличение абсолютного количества клеток CD4? Ответ. Наблюдаемое различие не обязательно означает значимое увеличение абсолютного количества клеток CD4. Значения абсолютного количества клеток CD4 возрастают с 09:00 до 16:30. Следует повторно взять образец крови у пациента приблизительно в 09:00, чтобы сравнение было значимым.

56 Программа на сегодня CD4 – Определение – Подклассы лимфоцитов – Гемопоэз CD4 и ВИЧ-инфекция Референс-диапазоны CD4 Научные исследования Резюме

57 CD4 белок, экспрессируемый на поверхности клеток T-хелперов. CD4 является рецептором для ВИЧ. ВИЧ инфицирует и разрушает CD4 T-клетки.

58 Резюме Показатель количества CD4-положительных T-клеток используется в качестве суррогатного маркера снижения иммунитета у ВИЧ-инфицированных лиц. Низкое количество CD4-положительных T-клеток не является диагностическим признаком ВИЧ-инфекции.

59 Резюме Референс-диапазон для значения CD4-положительных T-клеток меняется в зависимости от возраста пациента, времени получения образца и региона проживания. Каждая лаборатория, выполняющая анализ клеток CD4, должна определить или валидировать соответствующий референс- диапазон для анализируемой популяции.

60 Благодарю за участие! Остались ли какие-то вопросы?