Радиационное поражение живой клетки 19.11.2012. Стадии лучевого поражения клетки 1.Физическая (неспецифическая) ( 10 -16 -10 -14 с) – поглощение, перераспределение. - презентация

1 Радиационное поражение живой клетки

2 Стадии лучевого поражения клетки 1.Физическая (неспецифическая) ( с) – поглощение, перераспределение и деградация поглощенной энергии: возникновение ионизированных и возбужденных молекул, электронов и пр., неравномерно распределенных вдоль треков Радиационный выход активных частиц (G) G=7-10 частиц / 100 эВ На данной стадии процессы нельзя модифицировать, т.к. они зависят только от свойств излучения (ЛПЭ), а не от состояния клетки.

3 Стадии лучевого поражения клетки 2.Физико-химическая ( с) – реакции заряженных и возбужденных частиц, миграция энергии внутри молекул, диффузия радикалов (первичных, Н*, ОН*), е - гидр, межмолекулярные перестройки возбужденных и ионизированных клеточных структур Первичные радикалы быстро претерпевают вторичные превращения: образуются органические гидропероксиды и оксирадикалы органических молекул (например, ДНК и липидов мембран), которые взаимодействуют друг с другом. ! Возможна модификация процессов с помощью химических соединений, способных вступать в реакции со свободными радикалами и изменять характер миграции энергии. (SH-группы, О 2, др. химические модификаторы радиочувствительности – см. тему 3)

4 Стадии лучевого поражения клетки 3.Химическая ( с) – к этому времени уже произошли стойкие изменения – повреждения в структуре молекул. Происходит выравнивание продуктов радиолиза по объему. -Биологические мембраны: Интенсификация свободнорадикального перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот и накопление продуктов окисления мембран нарушение структуры и функции мембран -Макромолекулы белка: повреждение аминокислот нарушение первичной структуры изменение вторичной структуры нарушение конформации деградация активного центра ферментов (утрата каталитических свойств, субстратной специфичности, чувствительности к активаторам и ингибиторам) -ДНК: одно- и двунитиевые разрывы полинуклеотидных цепей, разрушение азотистых оснований возникновение сшивок ДНК- ДНК, ДНК-белок

5 Стадии лучевого поражения клетки 4.Биологическая – функциональные нарушения, формирование ответных реакций клетки: Перенос против градиента (активный) Облегченная диффузия (перенос по градиенту, пассивный) - Нарушение регуляторных функций мембран, повреждение мембраносвязанных (трансмембранных) белков, ПОЛ - Повреждение ядерной мембраны нарушения генетического аппарата

6 Биологическая стадия (продолжение) Структурные повреждения нуклеиновых кислот приводят к нарушению процессов репликации, транскрипции, трансляции генетической информации, запуску самоликвидации клеток Активируются защитные механизмы клеток Стадия длится от секунд до всего периода жизни клетки (!)

7 Стадии действия излучений – обобщенная схема (Цыб и др., с.67) физич Физ- хим химич биолог

8 Изменение радиочувствительности на разных стациях клеточного цикла М итотичеcкии цикл клетки М – митоз; G 0 – период покоя; G 1 – предсинтетический период (синтез белков и рост клетки); S – стадия синтеза ДНК; G 2 – постсинтетический период (фаза подготовки в митозу); Ключевые фазы клеточного цикла В профазе центриоли удваиваются, две образовавшиеся центриоли начинают расходиться к разным полюсам клетки. Ядерная мембрана разрушается. Специальные микротрубочки выстраиваются от одной центриоли к другой, образуя веретено деления. Хромосомы разъединяются, но всё ещё остаются попарно сцепленными. В метафазе хромосомы выстраиваются в экваториальной плоскости клетки. Центромеры, скреплявшие хромосомы, делятся, после чего дочерние хромосомы полностью разъединяются. В анафазе хромосомы перемещаются к полюсам клетки. Когда хромосомы достигают полюсов, начинается телофаза. Клетка делится надвое в экваториальной плоскости, нити веретена разрушаются, вокруг хромосом формируются ядерные мембраны. Каждая дочерняя клетка получает собственный набор хромосом и возвращается в стадию интерфазы.

9 Радиочувствительность клеток на разных стадиях клеточного цикла – эксперименты с синхронизированными клетками (остановка в одной из фаз генерационного цикла, например, введение веществ, препятствующих синтезу ДНК) Рис. Зависимость различий в выживаемости клеток китайского хомячка, облученных на разных стадиях генерационного цикла, от дозы излучения (доза указана в Гр около кривых) (1970 г) Наиболее радиочувствительны клетки в митозе При переходе от митоза к стадии S взрастает способность к репарации При увеличении дозы различия выживаемости клеток, облученных в разных фазах изменяется (например, в фазе G1, S, G2) – рис.

10 Радиационные эффекты, регистрируемые на уровне клетки

11 Радиационная задержка клеточного деления впервые количественно исследована в 50-е годы 20-го века 60-е гг. - опыты с синхронизированными клетками Рисунок. Сдвиг максимума митотической активности клеток почки человека при облучении в середине S-периода (Скайф, 1969), доза в Гр. Наибольший эффект достигается при облучении в стадиях S и G2, чем больше доза, тем продолжительней задержка деления Факторы, ответственные за задержку цикла 1) Система обнаружения дефектов ДНК в сверочных точках G1 и G2; 2) ????

12 Длительность задержки клеточного цикла 1)Длительность задержки деления зависит от того, в какой фазе цикла произошло облучение (максимальна – при облучении в S-фазе – причина- предположение: переход к репликации транскрипционно неактивной формы хроматина* гетерохроматина (около 90 % ДНК клетки составляет эухроматин и находится к деконденсированном состоянии); 2) величина задержки индивидуальна для разных клеток (примеры см. на стр Ярмоненко, Вайнсон, 2004) *вещество хромосом - ДНК

13 Судьба потомков облученной клетки Клетка облучена в S-фазе. 1 – погибшие клетки, 2 – гигантские клетки Секто- ральная гибель

14 Образование гигантских клеток Размеры могут в сотни раз превосходить нормальные (min в 15 раз по площади) В нормальных условиях число гигантских клеток не превышает 1-2% от общего числа Пути образования гигантских клеток: 1.Увеличение массы неделящейся клетки в результате деления ядер без деления самой клетки (клетки не могут разделиться); Ускоренное репликативное старение – клетки необратимо останавливаются в интерфазе, увеличиваются в размерах, накапливают характерные белки. В итоге активируется самодеструкция в виде апоптоза и некроза. 1.Слияние потомков только что разделившейся клетки (2, 3 и более) Итог: Клетки погибают из-за нарушения метаболизма

15 Утеря клоногенного потенциала (Clonogenic survival assay) основной способ оценки выживаемости клеток Синонимы: клоногенная активность, жизнеспособность, выживаемость I. Метод оценки выживаемости клеток In vitro: («золотой стандарт» ), 1956 г.: отделение клеток от стенок сосуда, разбивание суспензии на одиночные клетки, посев на чашку, подсчет колоний. Облучать клетки можно на разных этапах в зависимости от задачи. оценивается доля выживших клеток в % к числу посеянных колоний: клетка считается выжившей, если она образует колонию из > 50 клеток.

16 Влияние 241Am на жизнеспособность клеток E.coli работа выполнена в ИХБиФМ СО РАН Показано значительное ингибирующее действие 241 Am на рост клеток E.coli. В присутствии 241 Am заметное снижение скорости роста бактериальной культуры наблюдалось уже через два часа, а в стационарной фазе количество жизнеспособных клеток снижалось в раз в зависимости от активности 241 Am.

17 Токсическое влияние 241 Am, на стационарную культуру клеток S. typhimurium ТА102. Показано повышение гибели бактериальных клеток в присутствии раствора 241 Am (240 мБк/мл). В течение 3 суток происходит гибель более 90% клеток, тогда как в чистой воде гибель клеток не наблюдалась.

18 Утеря клоногенного потенциала II. Оценка выживаемости клеток In vivo - Модификации метода для стволовых клеток (1961 г.): экзоколониальный тест (оценка радиочувствительности гемопоэтических клеток донора) и эндоколониальный тест (оценка радиочувствительности собственных стволовых гемопоэтических клеток) – выращивание стволовых клеток (лимфом и лейкемии) на селезенке, утратившей собственную клеточную популяцию в результате облучения (стр.89 Ярмоненко, Вайнсон, 2004); Клетки берут от облученных в разных дозах животных. -Выращивание колоний в легких (для опухолей нелимфоидного происхождения), (Цыб и др., 2005, стр ) -выращивание колоний на капсуле почки, камере глаза, жировой подушке стопы (для опухолевых клеток, клеток медленно обновляющихся тканей) (см. Цыб и др., 2005, стр ) В настоящее время разработаны методы оценки выживания клоногенных клеток кожи и тонкого кишечника, хряща, молочной железы и др.

19 Длительное сохранение повышенной гибели потомков (снижение клоногенной способности) сохранение гибели части потомков облученной клетки в течение многих поколений Секторальная гибель – полная гибель всех потомков одной из двух дочерних клеток При облучении в фазе G1 клоногенность достигала нормы через 23 дня Для фазы S – через 10 дней

20 SOS-хромотест - метод анализа активности генотоксинов основан на индукции SOS ответа в клетках E. сoli (мутантах) SOS ответ включает ряд функций, которые индуцируются в ответ на повреждение ДНК или остановку ее синтеза. SOS-хромотест позволяет измерять способность различных веществ индуцировать экспрессию din-генов (генов, индуцибельных в ответ на повреждения ДНК) в E.coli по активности -галактозидазы, структурный ген которой, lacZ, поставлен под контроль промотора какого-либо din- гена. В штамме E.coli PQ37, используемом в SOS хромотесте, структурный ген -галактозидазы lacZ введен под контроль промотора din- индуцибельного гена sfiA, так что -галактозидазная активность сильно зависит от экспрессии гена sfiA и индуцируется при действии на клетки бактерий генотоксинов. Мутация в uvrA гене делает штамм дефицитным по эксцизионной репарации и поэтому увеличивает ответ к некоторым ДНК- повреждающим агентам. Мутация rfa позволяет улучшить диффузию некоторых химических веществ в клетку.

21 SOS-хромотест - метод анализа активности генотоксинов Анализ состоит в инкубации индикаторного штамма с увеличивающимися концентрациями тестируемых веществ. Спустя некоторый промежуток времени, необходимый для синтеза белка, определяют активность -галактозидазы. Тест выполняется отдельно в присутствии и в отсутствие микросомальной активирующей смеси. Тестируемые химические соединения могут при некоторых концентрациях ингибировать синтез белка, что, возможно, приведет к недоопределению индукции -галактозидазы. В экстремальных случаях это может дать неправильный отрицательный результат. Чтобы скорректировать это влияние тестируемых препаратов, определяют общий синтез белка в инкубационный период, анализируя параллельно с - галактозидазой активность щелочной фосфатазы, конститутивно экспрессируемого фермента.

22 Оценка генотоксичности 241 Am в SOS- хромотесте Зарегистрирована достоверное увеличение активности - галактозидазы (фактор индукции), которая коррелирует с индукцией экспрессии гена lacZ в индикаторном штамме E.coli PQ37 (sfiA::lacZ) в ответ на повреждения ДНК в присутствии 241 Am. Минимальная активность 241 Am, индуцирующая SOS ответ, составляет Бк на пробу.

23 Клеточные изменения при апоптозе и некрозе Стадии апоптоза: ml: 2) На ранних стадиях апоптоза, в отличии от некроза, клетка наоборот, сморщивается, теряя до 1/3 своего объема за несколько минут. 3) Далее апоптотическая клетка превращается в совокупность окруженных мембраной апоптозных телец различных по своему составу, 4) Апоптозные тельца фагоцитируются макрофагами или соседними клетками in vivo. Стадии некроза: 5) клетки набухают, их митохондрии и другие органеллы расширяются (вследствие нарушения работы ионных каналов), 6) разрываются внутриклеточные и плазматическая мембраны клетки - выход цитоплазмы во внеклеточное пространство – воспалительная реакция ткани. Апоптозоподобная ПГК (или аутофагия) – в отличие от апоптоза нет межнуклеосомальной деградации ДНК

24 Радиационная гибель клеток Апоптоз – (энергозависимый механизм) программируемая гибель клеток (ПГК). Годом признания апоптоза как физиологического явления, считается 1972 год, Kerr, Wyllie, Currie (англ.) Радиационный апоптоз характерен как для клеток быстроделящихся тканей (эпителиальных, костный мозг), так и для покоящихся (лимфоциты периферической крови) обнаружение специальными белками нарушений ДНК или мембран митохондрий инициирует апоптоз. Гибель по апоптотическому пути может происходить при повреждениях ДНК, не являющихся препятствием к жизнедеятельности клетки Апоптоз включается при дозах, не достигающих летальных значений Биологический смысл апоптоза – недопущение размножения клеток с ошибками в генетическом аппарате. Во взрослом организме апоптоз распространен в различных типах тканей. Он встречается как в медленно пролиферирующей популяции клеток (гепатоциты, клетки эпителия коры надпочечников), так и в быстро пролиферирующих клеточных популяциях. В первом случае он выполняет функцию гомеостатической регуляции оптимального объема ткани. Во втором случае роль апоптоза, в основном, связана с дифференцировкой клеток.

25 Радиационная гибель клеток – Некроз – « клеточная катастрофа» или вид ПГК (роль АТФ)?? Некроз реализуется при уровне поражений, несовместимых с жизнедеятельностью клетки. (причины: гипертермия, ингибирование окислительного фосфорилирования, гликолиза или цикла Кребса, гипоксия, действие различных токсинов) Радиационный некроз индуцируется большими дозами облучения (> 20Гр). Некротическим путем клетки обычно разрушаются при остановке в митозе. В норме встречается крайне редко, хотя обнаружен в нервной ткани и в эпителии кишечника.

26 Причины радиационной гибели клеток В результате лучевого поражения клетки гибнут как по апоптотическому, так и по некротическому пути -Гибель в первые часы после облучения обусловлена работой сигнальной системы включения ПГК в отчет на неотрепарированные двойные разрывы ДНК -Более поздняя гибель связана с обнаружением нарушений строения хромосом в периоде G2; -Гибель в митозе обусловлена хромосомными аберрациями

27 Интерфазная и митотическая гибель клеток

28 Интерфазная гибель клеток = Гибель неделящихся (нервные, мышечные) или медленно делящихся (печень) клеток при облучении изменения, предшествующие гибели клеток: Физиологические: -Нарушение ядерного фосфорилирования -Угнетение клеточного дыхания -Изменяется проницаемость мембран (тесты с исп. красителей, выход К + ) и др. Морфологические: -Набухание ядер -Вакуолизация и распад ядрышек Гибель клеток происходит в первые часы или сутки после облучения В зависимости от дозы и др. факторов, модифицирующих радиочувствительность

29 Митотическая (репродуктивная) гибель клеток = в основном, быстроделящихся Гибель в митозе обусловлена хромосомными аберрациями: Поврежденные хромосомы (генетический материал) не могут равномерно разделиться между дочерними клетками Двойной мост в анафазе митоза у элодеи канадской Неравномерное расхождение хромосом в анафазе митоза водяного лютика Отстающие хромосомы в анафазе митоза водяного лютика

30 Последствия радиационных повреждений ДНК: Эффекты, наблюдаемые в клетках Схема строения хромосомы в поздней профазе метафазе митоза. 1 хроматида; 2 центромера; 3 короткое плечо; 4 длинное плечо.

31 Фрагментация хромосом - Образование микроядер -фрагменты хромосом образуются в результате разрывов ДНК, -В интерфазе фрагменты формируют микроядра (участки конденсированной ДНК, тогда как остальные ДНК переходят в деконденсированное состояние), -микроядра в метафазе остаются в центре клетки, -распределяются между дочерними клетками случайным образом); -Передаются дочерним клеткам нескольких поколений -Число микроядер коррелирует с полученной дозой излучения -Проблемы интерпретации !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ( увеличение выхода микроядер у пожилых людей, причины? )

32 Хромосомные аберрации (Отражают число разрывов ДНК и дефекты их репарации) метод широко используется для оценки поглощенной дозы у человека и животных Аберрации (перестройки) хромосом и хроматид – (результат неправильного соединения разрывов ДНК: соединение участков из разных мест одной хромосомы или разных хромосом) Аберрации чаще изучают в метафазе (ана- телофазе), когда все интактные хромосомы расходятся к полюсам, а в центре клетки остаются фрагменты или связанные между собой хромосомы (мосты, см. рис.)

33 Аберрации хромосом Аберрации хромосом возникают, когда клетка облучена в предсинтетической стадии или в S- периоде, но до удвоения участков генома Виды хромосомных аберраций: -обмен фрагментами между хромосомами – реципрокные (взаимные) транслокации, -нарушения геометрии хромосом (дицентрики, ацентрические фрагменты – образуются при неверном воссоединении оторванных фрагментов ДНК).

34 Аберрации хроматид Аберрации хроматид возникают, когда клетка облучена после завершения репликации всей ДНК или того участка, разрыв которого приведет к формированию аберрации. Виды хроматидных аберраций: -Ацентрические фрагменты, укороченные хроматиды (результат разрыва) -кольцевые хромосомы (результат слипания концов хроматид) -внутрихромосомные обмены

35 Нарушение геометрии хромосом метафазная пластинка облученных лимфоцитов в, г - метафазная пластинка, содержащая дицентрические хромосомы, кольцевые хромосомы (указаны стрелками) Хромосомы клетки человека непосредственно перед делением ядра (увеличение в 950 раз). Хорошо заметно, что пары хромосом всё ещё связаны между собой центромерами.

36 Транслокации Некоторые заболевания – следствия транслокаций : Рак : несколько форм рака являются следствием транслокаций - описано в основном для форм лейкемии; Бесплодие: один из потенциальных родителей является носителем сбалансированной транслокации, которая является бессимптомной Синдром Дауна обусловлен (в 5% случаев) транслокацией трети хромосомы 21 в хромосому видов транслокаций участков генома

37 Изучение транслокаций: методы дифференцированной окраски участков хромосом, присоединение флюоресцентной метки к фрагментам ДНК, комплементарных для ДНК определенных участков генома. translocations.html#N10017

38 Стабильность аберраций Нестабильные аберрации – ацентрические фрагменты и дицентрики - ведут к гибели клетки или ее ближайших потомков из-за невозможности равномерного распределения генетического материала между дочерними клетками; Стабильные аберрации – перемещение участков пораженных хромосом (транслокации), с сохранением центромеры (могут сохраняться в организме в течение нескольких поколений)

39 Аберрации коррелируют с поглощенной дозой и используются для целей дозиметрии (подробно в след. лекциях): Аберрации лимфоцитов периферической крови используют для оценки поглощенной дозы При смертельной для человека дозе редкоионизирующих излучений (4,5-5 Гр) на каждый лимфоцит приходится одна аберрация

40 Радиационно-индуцированная нестабильность генома Часть клеток, выживших после облучения, может давать функционально измененное потомство, в котором с высокой частотой на протяжении многих поколений возникают de novo (без доп. облучения!) аберрации хромосом и генные мутации, в ряде случаев приводящие к повышенной клеточной смертности путем апоптоза В отличие от перманентной геномной нестабильности, приводящей к некоторым наследственным болезням, радиационно-индуцированная нестабильность генома имеет ряд особенностей: -не определяется возникновением стойких нарушений в первичной структуре ДНК; -не определяется копированием в клеточном потомстве радиационных повреждений ДНК родительских клеток, -не имеет клонального характера; -может возникать в клетках, не подвергавшихся облучению (эффект свидетеля); -Нестабильность может проявляться в отдаленные сроки после облучения (иногда через сотни циклов деления ).

41 Нестабильность генома: Сохранение НГ на протяжении десятков поколений клеток животных было впервые показано при облучении в больших дозах; В е гг. отечественными учеными было показано, что НГ может проявляться и у потомков клеток, облученных в малых дозах; НГ проявляется как после действия плотноионизирующего, так и редкоионизирующего излучения У многоклеточных организмов НГ проявляется в увеличении числа (частоты) соматических мутантных клеток

42 Механизм индукции и поддержания генетической нестабильности мало изучены: В развитии генетической нестабильности играет роль: увеличение поражения ДНК и снижение эффективности репарации - нарушение системы контроля клеточного цикла (экспериментальное подтверждение: возрастание генетической нестабильности в потомстве клеток, облученных в присутствии усилителя радиационных поражений ДНК) Измененный клеточный метаболизм (?)– не ясно как передается (поиск факторов передачи) - эксперименты по облучению цитоплазмы и ядер - реактивные продукты кислорода (усиление продукции активных форм кислорода, что приводит к увеличению оксидативных повреждний в молекулах ДНК и, как следствие, к увеличению количества мутаций)

43 Примеры: эксперименты по облучению цитоплазмы и ядер: облучение участков цитоплазмы ускоренными ядрами гелия: при прохождении 4 ядер через участок цитоплазмы (не отражалось на жизнеспособности клетки) у части потомков в течение 40 поколений наблюдались микроядра (результат фрагментации ДНК) При облучении ядра в такой же дозе образование микроядер в трех первых поколениях было более частым, чем при облучении цитоплазмы. Через несколько поколений эффект исчезал. Роль реактивных продуктов кислорода в увеличении числа мутаций (наблюдалось увеличение числа мутаций после облучения цитоплазмы. При введении перехватчиков радикалов и угнетении синтеза глутатиона (мощный антиоксидант!) число мутаций снижалось

44 Результаты экспериментов и выводы Облучение цитоплазмы приводит к учащению точковых мутаций (характерных для спонтанного мутагенеза) Локальное облучение ядра – к учащению хромосомных перестроек У мутантных клеток в нескольких десятках поколений сохраняется высокое содержание количества высокореакционных продуктов кислорода. Изменение метаболизма коррелировало с повышенной некротической и апоптотической гибелью Выводы Длительная нестабильность генома после облучения обусловлена: -непосредственным поражением генома самим излучением; -дополнительным поражением продуктами измененного клеточного метаболизма.

45 «Генетическая нестабильность обусловлена длительно сохраняющимся изменением функционирования клетки как целого, передаваемым потомству посредством эпигенетических механизмов» (подробности см. в Кудряшов, 2004) Повышенный уровень мутаций Повышенная частота хромосомных перестроек Сохраняется в течение и более генераций Радиационно-индуцированная нестабильность генома возникает после облучения в широком диапазоне доз, включая малые (

46 Следующая тема: радиационные эффекты в области малых доз излучения Задание на дом: Контрольная работа