Лекция 14. Современные методы для изучения регуляции метаболических реакций в клетке. Геномика и транскрипционный анализ. Проблема ИНФО. Современные возможности. - презентация

1 Лекция 14. Современные методы для изучения регуляции метаболических реакций в клетке. Геномика и транскрипционный анализ. Проблема ИНФО. Современные возможности определения структуры и функции нуклеиновых кислот. Геномные манипуляции и технологии искусственного синтеза геномов. Матричный и безматричный синтез ДНК. Методы геномной трансплантации.

2 Секвенирование I I II III Выделение геномной ДНК и создание библиотеки фрагментов. Сборка Аннотация и анализ

3 Достижения Многократная случайная фрагментация (Shotgun) Фрагмент ДНК

4 Создание библиотеки

5 Многократная случайная фрагментация (Shotgun) Фрагмент ДНК ~500 нп

6 Sanger Method: Generating Read 1.Start at primer (restriction site) 2.Grow DNA chain 3.Include ddNTPs 4.Stops reaction at all possible points 5.Separate products by length, using gel electrophoresis

7 Automatic DNA sequencing

8 Electrophoresis Diagrams

9 Использованные программы Phred ( - обработка хроматограмм LUCY ( – удаление концов вектора, оценка качества прочтений TIGR ( - сборка BAMBUS ( - взаимная ориентация контигов (построение скаффолдов)

10 Информационные проблемы 1 запуск до 100 гбп нуклеотидов – 10 терра байт данных – стоимость хранения до 10 тыс руб. – скорость передачи от часов При увеличении скорости оборудования на порядок – мы приближаемся к предельной скорости передачи данных и критической стоимости обработки информации Обработка данных 1 запуска сиквенатора – зачастую требует до запусков алгоритмов расчета. Стоимость вычислительных мощностей приближается к стоимости оборудования (но реактивы отсутствуют для компьютеров)

11 Молекулярные колонии

12

13

14

15

16

17

18

19 Системы второго поколения Genome sequencer 20/FLX Solexa 1G SOLiD system Polonator G.007

20 Системы третьего поколения без амплификационные (Single-molecular sequencing Методы второго поколения, использующие ПЦР, могут выдавать ошибки, вызванные амплификацией. SMS (Single-molecular sequencing) – новое поколение методов.

21 454 пиросеквенирование Амплификация в водно-масляной эмульсии Детекция во время синтеза – флуоресценция при отщеплении пирофосфата

22 454 пиросеквенирование – подготовка библиотеки Фрагментация геномной ДНК Получение тупых концов Пришивка адаптеров Получение одноцепочечной ДНК

23 454 пиросеквенирование – амплификация Библиотека фрагментов ДНКИммобилизация на бусинах Приготовление водно- масляной эмульсии ПЦР в эмульсии Получение одноцепочечной ДНК

24 454 пиросеквенирование – считывание

25

26 SOLiD & Polonator Амплификация в водно-масляной эмульсии Детекция путём лигирования

27 SOLiD – подготовка библиотеки

28 SOLiD – амплификация

29 SOLiD – считывание

30 Зонды Матрица Первый нуклеотид Второй нуклеотид

31 SOLiD – считывание 1. Праймирование и лигирование Сиквенсовый праймер АдаптерМатрица Лигаза 2. Детекция 3. Кэпирование Возбуждение Эмиссия

32 SOLiD – считывание 4. Отщепление флуоресцентной метки 5. Повторение цикла 6. Денатурация и отжиг нового праймера циклов

33 SOLiD – считывание 7. Повторение стадий 1-5 с новым праймером 8. Повторение цикла с последовательными праймерами Позиция Праймер Тестируемые позиции Цикл лигирования Праймерный цикл Вставка

34 Illumina SOLEXA Амплификация на твёрдой подложке Детекция во время синтеза – обратимые терминаторы с флуоресцентной меткой Четыре вида флуоресцентных меток Все нуклеотиды присутствуют одновременно

35 Illumina SOLEXA – подготовка библиотеки Адаптеры Фрагменты ДНК

36 Illumina SOLEXA – амплификация Считывание Фрагмент ДНК Адаптер Праймеры Адаптер Пришитые концы Свободные концы Молекулярные колонии Пришитые концы

37 Illumina SOLEXA – считывание Первый цикл считывания Следующий цикл считывания

38 Illumina SOLEXA

39 HeliScope Нет стадии амплификации – секвенирование индивидуальных молекул Детекция во время синтеза – обратимые терминаторы с флуоресцентной меткой Один вид флуоресцентной метки Последовательная промывка образца нуклеотидами

40 HeliScope Поли-А адаптерСеквенируемый фрагмент Поли-Т адаптер Детекция включения нуклеотидов Подложка

41 HeliScope A G C T Детекция флуоресценции Промывка dNTP Подложка

42

43

44

45 Новые методы секвенирования Метод амплификации Метод считывания 454ПЦР в эмульсииСинтез SOLiD & Polonator ПЦР в эмульсииЛигирование SOLEXA ПЦР на твёрдом субстрате Синтез HeliScopeНетСинтез

46 Методы нанопорового секвенирования

47

48

49

50

51

52

53

54 RNA-seq

55 "Reads"

56 Квантификация экспресии

57 Оборудование нового поколения для секвенирования ДНК в России Название учрежденияПлатформа РНЦ «Курчатовский институт», Москва Illumina GA IIx (×3) Applied Biosystems SOLiD 4 (×2) НИИ химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск Applied Biosystems SOLiD 4 454/Roche FLX Titanium Инновационно-технологический центр «Биологически активные соединения и их применение» РАН, Москва llumina GA IIx Институт общей генетики им Н. И. Вавилова, Москва Applied Biosystems SOLiD 4 llumina HiSeq 2000 Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН, Москва llumina GA IIx Генаналитика, Москва Applied Biosystems SOLiD 4 Секретная станция переливания крови, Киров 454/Roche FLX Titanium Лимнологический институт СО РАН, Иркутск 454/Roche FLX Titanium Центр «Биоинженерия» РАН, Москва 454/Roche FLX Titanium НИИ физико-химической медицины, Москва Applied Biosystems SOLiD 4 Биологический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова, Москва Applied Biosystems SOLiD 4

58 Синтез генома de novo

59

60 Химический синтез генома

61 Creating Bacterial Strains from Genomes That Have Been Cloned and Engineered in Yeast

62 Создание бактерии с химически-синтезированным геномом

63 Клетка элементарная единица строения и жизнедеятельности всех живых организмов Самостоятельное существование Самовоспроизведение Развитие Обмен веществ и энергии Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome Daniel G. Gibson, et al. Science 329, 52 (2010) Бактерии с химически синтезированным геномом быстро размножаются и внешне практически не отличаются от «диких» бактерий Mycoplasma mycoides.

64 Metabolic reconstruction of a minimal cell

65 Proteogenomics Sequencing New paradigm in genomic and proteomic research Annotation Proteomics

66 Draft genome Complete genome Library generation Sequencing Variety of MS/MS Reannotation Assembly and Annotation