ДНК-идентификация животных Экспертное исследование ДНК нечеловеческого происхождения Орехов В.А. ООО ГОРДИЗ 31 января 2013 г. г. Звенигород. - презентация

1 ДНК-идентификация животных Экспертное исследование ДНК нечеловеческого происхождения Орехов В.А. ООО ГОРДИЗ 31 января 2013 г. г. Звенигород

2 «Нечеловеческая» ДНК в экспертной практике Применяется с середины 90-х годов. В последнее время повышенный интерес, публикации, монографии: - Типирование нечеловеческой ДНК (Coyle, 2008) - Судебная микробиология (Budowle, 2011) - Рекомендации ISFG (2011)

3 Домашние животные: свидетели, нарушители, жертвы Россия занимает 2 место в мире после США по числу домашних животных на душу населения: 33% семей содержат кошек (25-30 млн. кошек), 20% семей содержат собак (20 млн. собак). При проникновении в помещение с домашним животным неизбежна «контаминация» шерстью (DAndrea, 1998) -> возможность привязки к месту преступления либо хозяину животного (мтДНК, реже STR). Животные-нарушители: нападения на людей -> доказательство виновности или невиновности (Австралия: 4 миллиона собак, ~ нападений на людей, большинство не раскрыто) Животные-жертвы: случаи жестокого обращения с животными

4 Домашние животные: собаки Охарактеризовано > 30 кандидатных STR-маркеров (три-, тетра-, пента- гекса-, Tom 2010; Berger, 2008; van Asch 2008). Опубликованы мультиплексы: DogFiler – 16 локусов (Wictum, 2013) Mini-DogFiler 3 мультиплекса с мини STR(Kun, 2013) Работают на волках, лисах, койотах Иерусалим - c 2012 база данных Генотипирование экскрементов Штраф > 100 USD Премия – упаковка корма Ранее в Петах-Тикве.

5 Домашние животные: кошки Охарактеризовано 49 кандидатных STR-маркеров (Menotti-Raymond, 1999, 2005) Предложена стандартная панель из 11 локусов. Реализовано – MeowPlex (Butler, 2002). MewPlex: 11 STR + SRY PD = 5,5 X ,3 X 10 13

6 Судебная ботаника 1.Связь с подозреваемого или жертвы с местом преступления через следы растений. Возможно при условии уникального видового состава растительности год – два семени дерева Parkinsonia aculeata с места преступления в багажнике пикапа подозреваемого – доказательство вины. (Yoon, 1993) 2. Географическое происхождение наркотиков (марихуана) Возможность отследить связь пользователя с дилером и производителем. Типирование высокополиморфных STR- маркеров позволяет различить даже инбредные линии. Возможен анализ смесей. (Hsieh, 2003). Возможно создание базы данных.

7 Судебная ботаника 15 STR multiplex PCR - Cannabis species Австралия, база данных (Howard, 2008) Шалфей предсказателей Salvia divinorum

8 Судебная микробиология и энтомология Идентификация биологических следов. Бактерии Lactobacillus crispatus и Lactobacillus gasseri специфичны для вагинальных секретов– возможность идентификации вагинальных выделений. Менструальное происхождение крови. Streptococcus – обнаруживаются только в ротовой полости человека – слюна, отличить кровь из ротовой полости от другой крови (Donaldson, 2010) Видовой состав бактерий и грибов почвы, найденной на одежде или обуви может дать привязку к конкретной местности. Биотероризм. Октябрь 2001 –атака на правительственные учреждения США. 22 почтовых конверта с сибирской язвой -> 5 человек погибло конвертов были протестированы на отсутствие сибирской язвы. ФБР – рабочая гурппа по судебной микробиологии (Budowle) Личинки насекомых Diptera – привязка трупа к месту преступления. Определение давности трупа по стадии развития личинок.

9 Анализ видовой принадлежности животных 1. Идентификация останков неизвестного происхождения (фрагменты костей). Человек или животное? 2. Незаконная торговля редкими и исчизающими видами (годовой оборот 20 млрд.$ в год). 3. Агрессия диких животных (нападение на людей, домашних животных). 4. Случаи незаконной охоты на диких животных.

10 Этапы анализа видовой принадлежности 1.Секвенирование участка мтДНК мтДНК - Контрольный регион – не пригоден, высокая внутривидовая изменчивость мтДНК ген Цитохрома b - наиболее удобен для идентификации видов позвоночных (Parson, 2000), позволяет дискриминировать даже близкие виды мтДНК – ген 12S рРНК – слишком консервативен. Информативно ~150 bp мтДНК – ген COI – консервативен, выбран проектом Barcode of life 648 bp 2. Анализ последовательности мтДНК: - Сравнение с референсными образцами; - Поиск гомологии в GeneBank; - Сравнение с референсной базой данных (Barcode of life)

11 Сравнение с референсными образцами Рекомендация ISFG – параллельно с исследуемыми образцами анализировать референсные образцы из надежного источника. Последовательности выравниваются Проводится филогенетический анализ

12 Поиск гомологии в GeneBank Последовательности загружаются в Blast: Поиск максимальной гомологии в базе GeneBank GeneBank - Нереферируемая база данных, может содержать ошибки

13 Nakamura et al. Int J Legal Med (2009) 123:177–184 Фрагментрый анализ мтДНК определение видовой принадлежности Человек Собака Бурый медведь Мишень: участок контрольного региона мтДНК –> высокий межвидовой полиморфизм по длине. Высокая чувствительность. Универсальный набор для всех млекопитающих. Применение: анализ неопознанных останков, преступления против дикой природы, смешанные образцы

14 Сравнение с референсной базой BOLD 3. Автоматизированный анализ в специализированных базах данных. BOLD - Barcode Of Life Database - Задача проекта – создание наиболее полного каталога всех видов планеты. Используется участок 648 bp гена COI. Собрано видов (2012): животных: растений: грибов и др

15 Идентификация лососевых – микросателлитные маркеры 8 тетрануклеотидных маркеров для идентификации 10 видов лососевых ЛокусСтруктура повтора OtsG68 (Williamson et al. 2002)(TAGA) n Ots102 (R J Nelson, T D Beacham 1998)(GCCT) n (GTCT) n One103 (Olsen et al. 2000)(ATCT) n N n (ATCT) n One109 (Olsen et al. 2000)(TAGA) n OMM1037 (Rexroad lll et al. 2002)(GAAA) n OMM1050 (Rexroad lll et al. 2002) (GATA) n N n (GATA) n N n (GATA)n Oki10 (Smith et al. 1998)(CTGT) n Ssa197 (OReilly et al 1996)(TG) n (TGAG) n Животовский Л.А., Шайхаев Е.Г., Шитова М.В. 2013, Биология моря

16 OMM1050 – идентификация гибридов лососевых Длины аллелей Кета Горбуша Нерка Кижуч Чавыча Сима Микижа Кунджа Голец Таймень , , , , ,0250, , ,975 Гибриды кеты и горбуши (Курильский ЛРЗ, 2011г.) Горбуша КетаГибриды Кижуч М - Маркер молекулярной массы 1, 2 – Горбуша, 139 п.н. 3, 4 – Кета, 155 п.н. 5, 6 – Гибрид горбуши и кеты, 139, 155 п.н. 7, 8 – Кижуч, 160,164 п.н.

17 ДНК- идентификация животных Методы, используемые для анализа ДНК человека: МетодПреимуществаНедостатки Секвенирование мтДНКВысокая чувствительность Универсальные праймеры Трудоемко, низкая информативность, проблемы со смесями STRВысокий дискриминирующий потенциал Необходимы нулеотидные последовательности маркеров, информация о уровне полиморфизма RAPDНизкая стоимостьНизкая воспроизводимость RFLPНизкая стоимостьНизкий дискриминирующий потенциал Оптимальная схема анализа: 1) Определение видовой принадлежности с помощью секвенирования мтДНК 2) Идентификация особи с использованием STR-маркеров. Если нет информации о последовательностях – секвенирование мтДНК.

18 Случай незаконной охоты на диких животных Дело по факту незаконной охоты на диких животных (п. а ч.1 ст. 258 УК РФ): 326 образцов: образца мышечной ткани; - 4 образца волос с луковицами; - 3 образца шкур (один лось, два бурых медведя); - 36 образцов, собранных с вещественных доказательств (перчатки, топор, смывы с вездехода и т.д.) Задача: 1. Определить видовую принадлежность образцов, изъятых при осмотрах мест происшествий; 2. Определить количество особей, которым принадлежат изъятые образцы; 3. Сравнить генотипы особей с генотипами на вещественных доказательствах Работа проводилась совместно с ООО «Центр Молекулярной Генетики», МГНЦ РАМН

19 Стратегия исследования и выбор маркеров Контрольные референсные образцы в соответствии с рекомендациями ISFG: 10 образцов бурого медведя (Ursus arctos) 10 образцов лося (Alces alces) предоставлены Институтом проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН Определение видовой принадлежности: - анализ нуклеотидной последовательности участка гена цитохрома b мтДНК позиции п.н.; - филогенетический анализ полученных последовательностей с привлечением референсных образцов; - поиск гомологии в GeneBank для образцов, не кластеризующихся с референсными образцами.

20 Результаты анализа видовой принадлежности При анализе нуклеотидных последовательностей гена цитохрома b выявлены гаплотипы следующих видов: - лось (Alces alces) образца ; - бурый медведь (Ursus arctos) - 18 образцов; - дикий кабан или домашняя свинья (Sus scrofa) - 1 образец ; - корова (Bos taurus) – 3 образца; - человек (Homo sapiens) – 6 образцов Сиквенс Выравнивание Дерево В кластерах с референсными образцами Определялись через Blast

21 Sus scrofa дикий кабан или домашняя свинья - Один вид (Sus scrofa); - Неразличимы на основе нуклеотидных последовательностей мтДНК гена цитохром b;

22 Animaltype Pig – 11 STR + маркер пола

23 Бурый медведь (Ursus arctos) выбор маркеров Нуклеотидная последовательность генома неизвестна. Описаны только динуклеотидные маркеры. Создан мультиплекс из 7 маркеров: МаркерОписание Диапазон длин амплифицированных фрагментов (п.н.) Mu10STR-маркер, 2 bp Mu50STR-маркер, 2 bp Mu59STR-маркер, 2 bp Mu23STR-маркер, 2 bp Mu51STR-маркер, 2 bp G10LSTR-маркер, 2 bp SRYпол-специфичный маркер88 Andreassen et al., 2012, 13 динуклеотидных маркеров

24 Лось (Alces alces) - выбор маркеров Полиморфизм вида Alces alces в России исследован слабо. Обычно адаптируются маркеры, описанные для коровы Bos taurus (разные семейства) -> низкополиморфные маркеры. Создан мультиплекс: 4 высокополиморфных динуклеотидных STR-маркера и маркер пола, Cervid 1 оказался мономорфным МаркерОписание Диапазон длин амплифицированных фрагментов (п.н.) BM6438STR-маркер, 2 bp Cervid1STR-маркер, 2 bp CSSM43STR-маркер, 2 bp BM1225STR-маркер, 2 bp SEпол-специфичный маркер225

25 Результаты STR-типирования Бурый медведь (Ursus arctos) - 10 разных генотипов в 10 референсных образцах: мультиплекс пригоден для идентификации; -в исследованных 18 образцах выявлено 2 генотипа (т.е. минимум 2 особи); - в связи с отсутствием популяционных данных невозможно оценить вероятность случайного совпадения. лось (Alces alces) - 10 разных генотипов в 10 референсных образцах: мультиплекс пригоден для идентификации; - в исследованных 268 образцах выявлено 9 генотипов (т.е. минимум 9 особей); - в связи с отсутствием популяционных данных невозможно оценить вероятность случайного совпадения.

26 Спасибо за внимание! Владимир Орехов ООО ГОРДИЗ моб: +7 (495) офис: +7(495)