Николаева Ксения Магистрант МГУ(ПФ) Институт белка РАН, группа генетики развития Инновационный подход к получению Wnt-лигандов. - презентация

1 Николаева Ксения Магистрант МГУ(ПФ) Институт белка РАН, группа генетики развития Инновационный подход к получению Wnt-лигандов.

2 Цель Создание технологии снижающей стоимость производства Wnt3а-лиганда.

3 Введение Белки семейства Wnt являются лигандами Wnt/Frizzled сигнального каскада. Наиболее изученным из них является Wnt3a-лиганд.

4 Wnt3а клеточной пролиферации и дифференциации. Он применяется в регенерационной медицине и как агент для выращивания стволовых клеток. Wnt3а-лиганд- фактор роста, участвующий в клеточной пролиферации и дифференциации. Он применяется в регенерационной медицине и как агент для выращивания стволовых клеток. было предположено и доказано, что белок Р0 стимулирует выработку Wnt3а-лиганда. В ходе экспериментов нашей лаборатории было предположено и доказано, что белок Р0 стимулирует выработку Wnt3а-лиганда.

5 Технология культивирования стволовых клеток на фидерном слое из мышиных фибробластов не позволяет вследствие иммунных реакций использовать клетки для введения в организм больного человека. Бесфидерное культивирование стволовых клеток позволяет избежать многих негативных эффектов. Необходимым компонентом данной технологии является Wnt3а-лиганд. Стволовые клетки человека растущие на фидерном слое фибробластов мыши.

6 Трудности получения. Wnt-лиганды гидрофобны и плохо растворимы. Их получение с помощью бактериальных клеток невозможно вследствие сложных путей секреции и модификаций (липидных и углеводных). Эукариотические клетки выделяют Wnt-лиганды в очень малых количествах, в результате чего их получение чрезвычайно дорого.

7 Стоимость 1 мкг Wnt3а-лиганда около 100$ Необходимая концентрация Wnt3а 100 нг/мл Стоимость Wnt3а для 1 мл культуры 10$ Стоимость Wnt3а для 1 л культуры $ Почему оптимизация производства Wnt-лигандов актуальна? Цена из каталога R&D Systems

8 На сегодня в России : Лицензии Росздравнадзора на осуществление забора и хранения клеточного материала (Банк стволовых клеток) имеют 10 учреждений: 1. ОАО "Институт Стволовых Клеток Человека" (Гемабанк)- Москва 2. ООО "Флора-мед" - Москва 3. ООО "Желдормфармтранс" (ассоциация "Мера-Мед") - Москва 4. ГУЗ Москвы "Банк стволовых клеток департамента здравоохранения г. Москвы" 5. ГУ Институт хирургии им. А.В. Вишневского РАМН - Москва 6. ООО "Криоцентр" - Москва 7. ГУП "Поволжский банк гемопоэтических клеток" - Самара 8. ЗАО "РеМеТэкс" - Москва 9. ООО "Бьюти Плаза" - Москва 10. ООО "Транс-Технологии" Санкт-Петербург. Enamine, Ltd – Киев, Украина Список опубликован во 2 номере журнала "Клеточная трансплантология и тканевая инженерия"

9 Разработка Создание клеточной культуры с повышенной экспрессией гена P0 для получения Wnt3а- лиганда с меньшими финансовыми затратами. Создание клеточной культуры с повышенной экспрессией гена P0 для получения Wnt3а- лиганда с меньшими финансовыми затратами. Клетки мышиных фибробластов линии L. Система была проверена на клетках мышиных фибробластов линии L. Получены предварительные результаты.

10 Методика Клетки экспрессирующие Wnt3аКлетки гиперэкспрессирующие Wnt3а и Р0 Перенос среды содержащей Wnt3а Выращивание клеток, интенсивность флуоресценции которых связана с содержание Wnt3а в среде. Измерение флуоресценции клеток

11 Содержание Wnt3а в среде. маркер День3 Wnt3a+P0 День3 Wnt3a День3 L-клетки День2 Wnt3a+P0 День2 Wnt3a+P0 День2 L-клетки День1 Wnt3a+P0 День1 Wnt3a День1 L-клетки L-клетки- контроль. Wnt3a-клетки, гиперэкспрессирующие дополнительный ген Wnt3a. Wnt3a+P0-клетки гиперэкспрессирующие дополнительный гены Wnt3a и P0.

12 Интенсивность флуоресценции клеток. (активность Wnt3a) Стимуляция средой, полученной от клеток гиперэкспрессирующих Wnt3a+P0 Стимуляция средой, полученной от клеток гиперэкспрессирующих Wnt3a

13 Сравнительная активность флуоресценции репортетных TOPdGFP-L клеток при стимуляции их средой. L-TOPdGFP+ P0 Wnt3a medium+ Wnt3a medium

14 Перспективы 1)Достичь большей экспрессии P0, и как следствие добиться повышения производства и активности Wnt3a-лиганда; 2)Оптимизировать методы выделения и очистки Wnt3а-лиганда. 3) Масштабировать все процессы.

15 Группа генетики развития