Использование методов культуры клеток и тканей растений in vitro для преодоления межвидовых репродуктивных барьеров Использование методов культуры клеток. - презентация

1 Использование методов культуры клеток и тканей растений in vitro для преодоления межвидовых репродуктивных барьеров Использование методов культуры клеток и тканей растений in vitro для преодоления межвидовых репродуктивных барьеров

2 Наиболее эффективным методом расширения генетической базы селекционного материала является гибридизация его с дикими и примитивными культурными родственными видами (отдаленная гибридизация). Наиболее эффективным методом расширения генетической базы селекционного материала является гибридизация его с дикими и примитивными культурными родственными видами (отдаленная гибридизация). В селекции нашло отражение два основных направления использования отдаленной гибридизации: В селекции нашло отражение два основных направления использования отдаленной гибридизации: с целью расширения генетической базы соответствующего культурного вида (расширения аллельного разнообразия) с целью расширения генетической базы соответствующего культурного вида (расширения аллельного разнообразия) для интрогрессии в селекционный материал отдельных ценных генов. для интрогрессии в селекционный материал отдельных ценных генов.

3 Выделяют следующие основные факторы, обеспечивающие обособление видов: - внешние экологические барьеры: физическое разделение популяций видов в пространстве и времени (несовпадение периода цветения), обусловленное их адаптацией к специфическим экологическим нишам; - геномные различия между видами; - различия в плоидности; - различия в плоидности; - внутренние барьеры, препятствующие гибридизации (пре- и постзиготные репродуктивные барьеры).

4 Презиготная несовместимость Презиготные барьеры (несовместимость) проявляются между опылением и оплодотворением в виде: непрорастания пыльцы на рыльце пестика; прорастания, но не сопровождающегося проникновением пыльцевой трубки в ткани пестика; проникновения трубки в ткани пестика, но при котором имеет место ингибирование роста пыльцевой трубки в разной степени и в разных частях столбика или в завязи

5 Постзиготные барьеры Постзиготные межвидовые барьеры проявляются в ходе или после оплодотворения, в течение процесса роста и развития, цветения растений F 1, или даже позднее в расщепляющихся поколениях F 2 и BC 1 Постзиготные межвидовые барьеры проявляются в ходе или после оплодотворения, в течение процесса роста и развития, цветения растений F 1, или даже позднее в расщепляющихся поколениях F 2 и BC 1

6 Группировка видов Solanum в соответствии с их плоидностью и EBN (по Hermsen 1994) Плоидность EBNВиды Solanum 2х1blb, brd, cap, chn, clr, cph, cmm, crc, etb, frn, jam, lgl, mrf, pld, pnt, trf, амфимоноплоиды аллотетраплоидных видов 2x2chc, chm, ifd, tar, sect. Megistacroloba и Tuberosa, за исключением chn, дигаплоиды естественных и искусственных автотетраплоидов 4х2Все аллотетраплоиды: acl, agf,col, fen, hjt, opl, plt, pta, scr, sto, tuq; все удвоенные 2х, 1 EBN виды 4х4х4tbr subsp. tbr и adg; все удвоенные 2х, 2 EBN виды (автотетраплоиды) 6х6х4Sect. Demissa; acl subsp. albicans

7 Опыление in vitro для преодоления межвидовой несовместимости Впервые этот метод был успешно применен индийскими учеными [Kanta et al., 1962] для получения самоопыленного потомства у самонесовместимого мака Papaver somniferum Впервые этот метод был успешно применен индийскими учеными [Kanta et al., 1962] для получения самоопыленного потомства у самонесовместимого мака Papaver somniferum Метод включает: - обнажение семяпочки или семяпочек путем удаления тканей пестика и завязи, - нанесение на них пыльцы - культивирование оплодотворенных семяпочек на питательной среде до образования зрелых семян Варианты метода: опыление и культивирование - изолированных завязей, - семяпочек, прикрепленных к плаценте, - семяпочек без плаценты

8 Применение эмбриокультуры для устранения последствий постгамной межвидовой несовместимости Первым продемонстрировал возможности использования культуры изолированных зародышей для целей преодоления межвидовых репродуктивных барьеров у льна Laibach (1925, 1929) Первым продемонстрировал возможности использования культуры изолированных зародышей для целей преодоления межвидовых репродуктивных барьеров у льна Laibach (1925, 1929) Зародыши вычленяют в стерильных условиях из гибридных семян, помещают их на питательную среду и при культивировании на свету добиваются регенерации из них растений. Эффективность регенерации растений в культуре зародышей в значительной степени зависит от размера эксплантата и стадии развития зародыша: чем больше эксплантат и чем более зрелый зародыш, тем выше вероятность регенерировать из него растение Зародыши вычленяют в стерильных условиях из гибридных семян, помещают их на питательную среду и при культивировании на свету добиваются регенерации из них растений. Эффективность регенерации растений в культуре зародышей в значительной степени зависит от размера эксплантата и стадии развития зародыша: чем больше эксплантат и чем более зрелый зародыш, тем выше вероятность регенерировать из него растение

9 Получение межвидовых гибридов путем слияния протопластов для интрогрессии ценных генов в селекционный материал Первая методика слияния протопластов, основанная на применении нитрата натрия, была разработана в лаборатории Э. Кокинга в Ноттингемском университете [Power et al., 1970, Evans, Cocking, 1975]. С помощью этой методики в США в 1972 г были получены первые растения соматических гибридов между разными видами табака (Nicotiana glauca+N. langsdorffii) [Carlson et al. 1972] Первая методика слияния протопластов, основанная на применении нитрата натрия, была разработана в лаборатории Э. Кокинга в Ноттингемском университете [Power et al., 1970, Evans, Cocking, 1975]. С помощью этой методики в США в 1972 г были получены первые растения соматических гибридов между разными видами табака (Nicotiana glauca+N. langsdorffii) [Carlson et al. 1972]

10 Соматическая гибридизация Технология соматической гибридизации включает следующие этапы: Технология соматической гибридизации включает следующие этапы: - получение суспензий протопластов двух видов растений, гибриды между которыми предполагается получить, - получение смешанной суспензии протопластов двух видов и использование экспериментальных воздействий (химических или электрических), обеспечивающих слияние протопластов, - отбор продуктов слияния, - получение из них каллюсной культуры и регенерация растений соматических гибридов, - подтверждение гибридности растений-регенерантов

11 Соматическая гибридизация Химическое слияние: в качестве первого «фьюзогена» использовали NaNO 3 [Power et al., 1970]. Позднее были предложены менее токсичные и более эффективные воздействия. Наибольшее распространение получили следующие системы слияния протопластов: - высокая концентрация в среде ионов Ca 2+ (около 50 мМ) и высокая рН (9-11) при 37 о С [Keller, Melchers, 1973]; - добавка в среду полиэтиленгликоля (ПЭГ) [Kao, Michayluk, 1974; Wallin et al. 1974]; - сочетание ПЭГ + высокая концентрация ионов Ca 2+ и высокая рН. Полиэтиленгликоль используют молекулярной массой в концентрации 15-45%, продолжительность воздействия мин. Его применение обеспечивает высокую частоту слияния протопластов (выше 30%) большого числа видов растений. Полиэтиленгликоль используют молекулярной массой в концентрации 15-45%, продолжительность воздействия мин. Его применение обеспечивает высокую частоту слияния протопластов (выше 30%) большого числа видов растений.

12 Соматическая гибридизация Метод электрослияния протопластов растений впервые был предложен Zimmermann, Scheurich (1981). Метод электрослияния протопластов растений впервые был предложен Zimmermann, Scheurich (1981). Электрослияние осуществляют в специальной кювете прибора с двумя электродами, расстояние между ними 0,2 мм. Через питательную среду, в которую помещают суспензию протопластов двух видов, пропускают высоковольтные импульсы (синусоидальная волна; расстояние между пиками 5-10 В; частота 500 кгц; напряжение от 200 В до 350 В, длительность импульса ~50 мс;). Электрослияние осуществляют в специальной кювете прибора с двумя электродами, расстояние между ними 0,2 мм. Через питательную среду, в которую помещают суспензию протопластов двух видов, пропускают высоковольтные импульсы (синусоидальная волна; расстояние между пиками 5-10 В; частота 500 кгц; напряжение от 200 В до 350 В, длительность импульса ~50 мс;). Под действием тока на электродах образуются агрегаты из 2-3 протопластов, либо цепочки из 5÷6 протопластов между электродами. В это время на электроды подают единичные импульсы постоянного тока, которые приводят к образованию пор в сильно сжатых мембранах протопластов. В результате происходит перемешивание цитоплазмы контактирующих протопластов и образуются гибридные протопласты. Под действием тока на электродах образуются агрегаты из 2-3 протопластов, либо цепочки из 5÷6 протопластов между электродами. В это время на электроды подают единичные импульсы постоянного тока, которые приводят к образованию пор в сильно сжатых мембранах протопластов. В результате происходит перемешивание цитоплазмы контактирующих протопластов и образуются гибридные протопласты.

13 Соматическая гибридизация Методы отбора продуктов слияния протопластов: Механическая изоляция Механическая изоляция Генетическая комплементация Генетическая комплементация Физиологическая комплементация Физиологическая комплементация Инактивация протопластов одного из родителей до слияния протопластов Инактивация протопластов одного из родителей до слияния протопластов Физическое обогащение Физическое обогащение

14 Соматическая гибридизация Симметричные соматические гибриды Симметричные соматические гибриды Асимметричные соматические гибриды Асимметричные соматические гибриды Цибриды. Цибриды. Подтверждение гибридности растений- регенерантов, полученных после слияния протопластов: исследование морфологических признаков исследование морфологических признаков оценка селекционной ценности гибридов оценка селекционной ценности гибридов анализ изоферментов анализ изоферментов анализ ДНК-маркеров, в том числе видоспецифичных маркеров отдельных хромосом, генов родительских видов анализ ДНК-маркеров, в том числе видоспецифичных маркеров отдельных хромосом, генов родительских видов цитогенетические методики цитогенетические методики

15 Проблемы беккроссирования соматических гибридов культурным родителем - Сильные геномные различия родительских видов (соматические гибриды – аллополиплоиды) - Различия в плоидности соматических гибридов и культурного родителя - Презиготная несовместимость соматических гибридов с культурным родителем - Постзиготные репродуктивные барьеры при гибридизации соматических гибридов с культурным родителем

16 Проблемы беккроссирования соматических гибридов культурным родителем При использовании соматических гибридов в качестве материнской формы беккроссирование не может быть успешным, так как в пестиках таких гибридов присутствуют РНКазы, которые являются продуктами S-генов обоих родительских видов). S- РНКазы дикого вида не могут быть дезактивированы ингибиторами РНКаз, присутствующими в пыльцевых трубках S. tuberosum, что приводит к развертыванию реакции несовместимости При использовании соматических гибридов в качестве материнской формы беккроссирование не может быть успешным, так как в пестиках таких гибридов присутствуют РНКазы, которые являются продуктами S-генов обоих родительских видов). S- РНКазы дикого вида не могут быть дезактивированы ингибиторами РНКаз, присутствующими в пыльцевых трубках S. tuberosum, что приводит к развертыванию реакции несовместимости

17 Расщепление по S- локусу в результате мейоза у соматических гибридов S. tuberosum +S. pinnatisectum ( tbr+pnt) S-локус Гаметы S-локус Гаметы соматического гибрида соматического гибрида S pnt S pnt S pnt S pnt S pnt S pnt S pntмейоз S pnt S tbr S pntмейоз S pnt S tbr S tbr S tbr S tbr S tbr S tbr S tbr S tbr S tbr

18 Подходы к преодолению презиготной несовместимости и культурного родителя - Использование соматических гибридов в беккроссах в качестве опылителя - Получение дигаплоидов соматических гибридов с помощью гаплопродюсера - Получение удвоенных дигаплоидов соматических гибридов с помощью культуры пыльников

19 Дигаплоиды соматических гибридов (2n=2x=24) S.tuberosum+S.pinnatisectum

20 Образование каллюса в культуре пыльников соматических гибридов (2n=4x=48) S.tuberosum+S.bulbocastanum

21 Регенерация растений в культуре пыльников соматических гибридов (2n=4x=48) S.tuberosum+S.bulbocastanum

22 Соматические гибриды tbr+blb (слева) и андрогенетические растения-регенеранты соматических гибридов (удвоенные дигаплоиды (2n=4x=48)