Принципы построения биосенсорных устройств Лекция 4 Преподаватель: Успенская Майя Валерьевна. - презентация

1 Принципы построения биосенсорных устройств Лекция 4 Преподаватель: Успенская Майя Валерьевна

2 Под термином биосенсор понимают устройство, в котором чувствительный слой содержит биологический материал: ферменты, ткани, бактерии, дрожжи, антигены/антитела, липосомы, органеллы, рецепторы, ДНК. Этот слой непосредственно реагирует на присутствие определяемого компонента и генерирует сигнал, зависящий от концентрации этого компонента. Биосенсоры. Биологические датчики Биосенсоры – разновидность химических сенсоров, в которых система распознавания имеет биохимическую природу и использует реакции либо индивидуальных биомолекул, либо биологических надмолекулярных структур.

3 ПРИНЦИПЫ РАБОТЫ БИОСЕНСОРОВ Конструктивно биосенсор аналогичен остальным видам химических сенсоров и состоит из двух преобразователей (биохимического и физического) находящихся в тесном контакте друг с другом. При этом биохимический преобразователь, или биотрансдьюсер, выполняет функцию биологического элемента распознавания, преобразуя определяемый компонент, а точнее, информацию о химических связях в физическое или химическое свойство или сигнал, а физический преобразователь позволяет зарегистрировать этот сигнал. Наличие в устройстве биоматериала с уникальными свойствами позволяет с высокой селективностью определять нужные соединения в сложной по составу смеси, не прибегая к дополнительным операциям, связанным с использованием других реагентов. В качестве трансдьюсеров могут быть использованы любые из упомянутых в данной статье: электрохимические, спектроскопические, термические, пьезоэлектрические, на поверхностных акустических волнах и интегрально- оптические.

4 Принципиальная схема биохимического сенсора 1 – исследуемый раствор; 2 – корпус биосенсора, 3 – полупроницаемая мембрана (для механического удержания биослоя), 4 – слой биоматериала, 5 – физический преобразователь (электрод, пьезокристалл и т.д.), 6 - усилитель сигнала, 7 - самописец

5 Схема биосенсора Биосенсор состоит из двух преобразователей (трансдьюсеров): биохимического и физического. Биохимический преобразователь выполняет функцию биологического элемента распознавания, преобразуя определяемый компонент, а физический преобразователь – это свойство фиксирует с помощью специальной аппаратуры.

6 Действие биосенсоров Биослой (биологический элемент распознавания) состоит из: целых организмов, живых тканей, клеток, органелл, мембран клеток, ферментов (индивидуальных), препаратов ферментов (неочищенных), рецепторов, антител, нуклеиновых кислот Основано на важнейших химических реакциях живых организмов: реакции антитело/антиген, фермент/субстрат, рецептор/гормон. Такие реакции используются для получения высоко селективных и чувствительных биосенсоров на конкретные определяемые вещества. В биосенсорах узнающим реагентом обычно является макромолекула, иммобилизованная внутри мембраны, либо химически связанная с поверхностью, которая контактирует с раствором определяемого вещества.

7 Принцип работы биосенсора Определяемое вещество диффундирует через полупроницаемую мембрану в тонкий слой биокатализатора, в котором и протекает ферментативная реакция по схеме, представленной на рисунке слайда 4. Поскольку в данном случае продукт ферментативной реакции определяется с помощью электрода, на поверхности которого закреплен фермент, то такое устройство называют ферментным электродом.

8 Между реагентом и определяемым веществом проходит специфическая химическая реакция. Это может быть либо прямое взаимодействие реагента с определяемым веществом, как в случае реакции антиген/антитело, либо каталитическое взаимодействие иммобилизованного фермента с определяемым веществом с образованием легко определяемого продукта.

9 Некоторые биосенсоры работают по принципу «да-нет», что приемлемо, в случае определения присутствия ультра малых количеств высокотоксичных веществ в объектах окружающей среды. Если определяемые компоненты находятся в сложной смеси или матрице, или близки по своим свойствам, то при анализе используются хроматографические методы разделения.

10 в отличие от химических датчиков является высокая специфичность биоузнающего элемента, а также его способность осуществлять узнавание без дополнительных затрат энергии и внешних воздействий (повышения температуры, наложения потенциала и т.д.). Подобная специфичность позволяет количественно определять индивидуальное анализируемое вещество либо группу веществ в смеси огромного числа подобных соединений. Например, при помощи фермента глюкозоксидазы можно анализировать содержание глюкозы как в присутствии прочих моносахаридов, так и при наличии ди-, три- и полисахаридов, содержащих остатки глюкозы, поскольку фермент имеет абсолютную специфичность. Уникальная особенность биосенсоров

11 Эффективность биосенсора определяется его аналитическими характеристиками. Аналитические характеристики включают: свойства аналитического сигнала (вели чина и время отклика) в ответ на добавление анализируемого вещества, обратимость системы после удаления аналита, стабильность датчика и многие другие. Остановимся на наиболее важных из них.

12 КАЛИБРОВОЧНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Для получения количественной информации о содержании анализируемых веществ в образце необходимо знать калибровочные характеристики биосенсора, то есть зависимость аналитического сигнала от концентрации. Поскольку биосенсоры могут использоваться как в составе аналитических систем (FIA, ВЭЖХ), так и независимо от них, то и при описании калибровки необходимо указывать, в каких условиях она была получена. Собственно градуировочный график

13 Для сравнения эффективности биосенсоров используются количественные характеристики: Чувствительность и предел обнаружения. Чувствительность определяется, как максимальное значение производной величины отклика по концентрации. Соответственно чувствительность имеет размерность [АМ1см2].

14 Нижний предел обнаружения Следует, отличать реально достижимый нижний предел обнаружения от вычисленного из градуировочного графика, поскольку последний зачастую экстраполируют через несколько порядков по концентрации анализируемого вещества. На нижнем пределе обнаружения отклик аналитической системы должен по крайней мере в 3 раза превышать отклик на нулевую концентрацию анализируемого вещества. Кроме того, выше нижнего предела обнаружения отклик должен существенно зависеть от концентрации. В случае амперометрических биосенсоров можно проследить также следующую закономерность. Повысить чувствительность датчика оказывается возможно путем увеличения количества иммобилизованного фермента либо за счет увеличения истинной поверхности поверхности индикаторного электрода на микроуровне (увеличения фактора шероховатости).

15 Нижний предел обнаружения Однако эти ухищрения, как правило, приводят к смещению нижнего предела обнаружения, особенно если он удовлетворяет требованиям, описанным выше, в область более высоких концентраций аналита. Таким образом, объективной характеристикой биосенсора может являться отношение его чувствительности к пределу обнаружения. По традиции часто указывают также величину линейного диапазона отклика биосенсоров. Однако в условиях современного развития вычислительной техники линейность отклика не является обязательной характеристикой аналитических систем.

16 ВРЕМЕНА СТАЦИОНАРНЫХ И МГНОВЕННЫХ ОТКЛИКОВ Время стационарного отклика сенсора при добавлении анализируемого вещества в систему определяется как время, необходимое для достижения 90% значения стационарного отклика. Время мгновенного отклика соответствует времени, необходимому для достижения максимальной величины первой производной сигнала (dR/dt)макс после добавления определяемого вещества. Обе величины в основном определяются скоростями массопереноса реагентов и продуктов через мембраны биосенсора и активностью систем биологического распознавания чем выше активность, тем меньше время отклика.

17 Важной операционной характеристикой биосенсоров как в стационарном, так и в проточном режиме является пропускная способность системы, определяющаяся числом проанализированных отдельных проб в единицу времени. Кроме времён стационарного или мгновенного откликов, данный параметр включает в себя время, необходимое для выхода сигнала на исходный уровень.

18 На рис. представлен анализ глюкозы на проточноинжекционном анализаторе, осуществляющем инжектирование анализируемого образца в поток фонового буфера, протекающего через проточную электрохимическую ячейку с рабочим электродом, расположенным в потоке по принципу wall-jet. Отклик системы на появление анализируемого образца регистрируется в виде пиков тока (рис.), высота которых пропорциональна концентрации аналита. Технические характеристики прибора позволяют проводить быстрое (менее 2 мин на анализ) и высокочувствительное определение глюкозы.

19 СЕЛЕКТИВНОСТЬ Величина селективности биосенсора зависит как от биочувствительного рецептора, так и от трансдьюсера. В основном селективность биосенсора определяют следующими способами: по отношению величин откликов на анализируемое вещество и на мешающий компонент, взятых в одинаковых концентрациях; по изменению отклика биосенсора (в %) при разбавлении вдвое раствора определяемого вещества раствором мешающего компонента известной концентрации, добавляемым в систему.

20 СЕЛЕКТИВНОСТЬ Несмотря на то, что многие ферменты являются строго специфичными, класс-селективные (неселективные) ферменты используются для создания класс-специфичных биосенсоров, применяемых при мониторинге состояния окружающей среды и анализе пищевых продуктов. В частности, для экспресс-контроля загрязнения сточных вод фенолами, анилинами, детергентами, тяжелыми металлами и пестицидами были разработаны сенсоры на основе иммобилизованных холинэстераз и пероксидазы.

21 ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ И СТАБИЛЬНОСТЬ Воспроизводимость биосенсора есть оценка разброса или кучности данных в серии наблюдений или результатов за определенный период времени. Операционная стабильность сенсоров характеризуется остаточной активностью (% от исходной) биосенсора после нескольких последовательных измерений в течение определенного периода времени. В частности, операционная стабильность глюкозного биосенсора на основе Берлинской лазури соответствует 100%му сохранению отклика в течение 10 ч работы.

22 ВРЕМЯ ЖИЗНИ Время жизни биосенсора рекомендуется определять как время хранения или работы, во время которого происходит уменьшение чувствитетельности на 10…50%. Также для определения времени жизни при хранении допустимо сравнивать чувствительности биосенсоров, рассчитанных одним методом, после различных периодов хранения в одних и тех же условиях.

23 Биосенсоры, функционирующие без добавления реагента, называют безреагентными, с добавлением реагента – реагентными. Биосенсоры, способные быстро и воспроизводимо восстанавливаться, называют многоразовыми. С помощью таких устройств осуществляют прямой мониторинг увеличения или уменьшения концентрации определяемого вещества. Биосенсоры, которые не могут быть воспроизводимо и быстро восстановлены, т.е. теряют свои функциональные свойства должны называться одноразовыми, к их числу относятся био- тесты и биоиндикаторы. Потенциальное использование таких устройств, особенно в мониторинге состояния окружающей среды, в большей степени ориентировано на системы предупреждения, не требующие точного определения концентрации анализируемого вещества. Классификация биосенсоров

24 Принципиальная схема действия биосенсора На рис. представлена принципиальная схема действия биосенсора, состоящего, как уже указывалось, из пространственно соединенных трансдьюсера и иммобилизованного биоузнающего элемента. На первом этапе действия биосенсора происходит «узнавание» биоэлементом специфического для него вещества из многокомпонентной смеси. На второй стадии происходит преобразование информации о протекании биохимической реакции в форму электрохимического или прочего (например, оптического) сигнала. Эта стадия, собственно, и является ключевой для осуществления работы биосенсора. Стадия сопряжения биохимической и электродной (либо прочей физико-химической) реакций. На последней стадии электрический сигнал от трансдьюсера преобразовывается в нужную для обработки форму.

25 Биосенсоры классифицируются по механизму биологического узнавания; по типу используемого трансдьюсера.

26 Биосенсоры классифицируются по пути используемого трансдьюсера Электрохимические, Оптические Гравиметрические.

27 Электрохимические биосенсоры Преимущества: являются менее зависимыми от эффектов окружающей среды, чем оптические, позволяют осуществлять перенос информации, преобразованной в электрическую форму, непосредственно на компьютер.

28 Электрохимические биосенсоры разделяют на По способу измерения сигнала амперометрические, потенциометрические, кондуктометрические сенсоры, полевые транзисторы. Последние, очевидно, являются разновидностью потенциометрических сенсоров.

29 Амперометрия Сущность метода амперометрии состоит в измерении тока окисления или восстановления электроактивных частиц. В большинстве случаев в ходе эксперимента на единичном рабочем электроде (или на пучке электродов), задаётся постоянный потенциал относительно электрода сравнения. Наблюдаемый ток оказывается пропорционален либо объёмной концентрации электроактивных частиц, либо скорости их расхода или образования в биокаталитическом слое.

30 Схема глюкозного биосенсора на основе Берлинской лазури В качестве примера можно привести разработанный нами глюкозный биосенсор, обладающий на сегодняшний день наилуч- шими аналитическими характеристиками. Биосенсор создан на основе Берлинской лазури (см.рис.), являющейся в свою очередь наиболее эффективным катализато- ром восстановления пероксида водорода. Действие биосенсора основано на следующих химических реакциях. Глюкоза окисляется кислородом воздуха в активном центре фермента. При этом кислород восстанавливается до пероксида водорода. Последний селективно восстанавливается на электроде, модифицированном Берлинской лазурью, продуцируя аналити-ческий сигнал, пропорциональный концент-рации глюкозыв анализируемом образце.

31 Отклик биосенсора, включенного в проточно- инжекционную систему, представлен на рис.

32 Потенциометрия Потенциометрические измерения состоят в определении разности потенциалов в условиях предельно малого тока либо между рабочим электродом и электродом сравнения, либо между двумя электродами сравнения, разделёнными полупроницаемой мембраной. В качестве трансдьюсера, как правило, выступает ионселективный электрод. Наиболее часто потенциометрические биосенсоры разрабатывают на основе рН-электродов. Фундаментальным пределом чувствительности подобных устройств является чувствительность трандьюсера. Чувствительность ионселективных потенциометрических электродов (мембранных электродов, в том числе стеклянных рН электродов, полевых транзисторов и т.д.) согласно уравнению Нернста не может превышать 59 мВ на единицу рН либо на единицу логарифма концентрации иона.

33 Превзойти теоретический предел, очевидно, можно только с использованием альтернативного физического принципа, например, если потенциал индикаторного электрода поддерживается за счет электрохимической реакции, находящейся в равновесии. Согласно уравнению Нернста, чувствительность потенциала к рН среды определяется соотношением протонов и электронов, участвующих в реакции. При соотношении 1:1 изменение потенциала на единицу рН составляет 59 мВ. Если же перенос электронов сопровождается отщеплением большего числа протонов, то изменение потенциала превысит названную величину. Так, при использовании полианилина в качестве рН трансдьюсера в широком диапазоне рН (1–9) удалось добиться рекордной чувствительности: 90 мВ/рН. Соответствующий биосенсор также значительно превышал по чувствительности существующие аналоги. Потенциометрия

34 Кондуктометрия Кондуктометрические и прочие (например, импедиметрические) способы измерения заметно меньше распространены в биосенсорах, особенно если в качестве биоузнающего элемента используется фермент. Однако их нельзя сбрасывать со счетов, если речь идет о детекции афинных взаимодействий.

35 Полевые транзисторы Системы с ионочувствительными полевыми транзисторами по сути являются обычными потенциометрическими системами, только входной транзистор перенесен из электронной схемы высокоомного вольтметра непосредственно в анализируемый раствор. Это позволяет существенно повысить разрешающую способность трансдьюсера и тем самым увеличить чувствительность изготовленных на их основе биосенсоров. Биочувствительный слой обычно помещают непосредственно на поверхности ионочувствительной мембраны, являющейся частью затвора полевого транзистора. Существенным недостатком всех потенциометрических систем, основанных на описанных принципах, является их чувствительность к буферной емкости раствора, что заметно ограничивает их применение.

36 Оптические биосенсоры Недостатки трансдьюсера чувствительность к различным параметрам среды, в том числе к локальному изменению температуры, что в ряде случаев драматически сказывается на избирательности системы.

37 Гравиметрические трансдьюсеры основаны на принципе резонанса акустической волны, распространяющейся вдоль поверхности кварцевого кристалла (QCM). Резонансная частота по уравнению Соусбери линейно зависит от изменения массы на поверхности кристалла. Однако при разработке биосенсоров приходится сталкиваться с еще одним обстоятельством: резонансная частота также оказывается зависимой от «вискозоэластического» коэффициента, который претерпевает существенные изменения в присутствии полимеров и, в том числе, биополимеров. Известны примеры ДНК-сенсоров, демонстрирующих отрицательный отклик (уменьшение массы) в ответ на связывание комплементарной молекулы олигонуклеотида.

38 Элементы биологического узнавания (или распознавания) классифицируются по типу связывания с анализируемым веществом 1) Биокаталитическое или продуктивное связывание Принципиальную схему продуктивного связывания можно представить следующим образом: E + S ES E + P, где E биомолекула, осуществляющая узнавание, S анализируемое вещество, P продукт(ы) реакции. При биокаталитическом типе связывания комплекс биомолекулы с анализируемым веществом не является тупиковым, а приводит к образованию продукта.

39 Биокаталитическое или продуктивное связывание Селективность распознавания обусловливается селективностью биокатализатора. Элементы биологического узнавания биокаталитического типа представлены, в основном, ферментами либо группами ферментов. Каталитические свойства прочих биомолекул: антител (абзимы) или нуклеиновых кислот (рибозимы) если и используются в биосенсорах, то крайне редко. Зачастую вместо выделенных ферментов в качестве распознающего элемента могут использоваться целые клетки, как правило, микроорганизмов.

40 Биокаталитическое или продуктивное связывание Следует, однако, понимать, что целые клетки не могут обеспечить избирательности анализа, поскольку они содержат огромное множество ферментных систем, каждая из которых может вызвать отклик трансдьюсера на группу своих субстратов. Наиболее известным примером биосенсоров на основе ферментов являются глюкозочувствительные электроды, пригодные для высокоизбирательного анализа глюкозы в крови. Глюкозные сенсоры основаны на каталитическом действии фермента глюкозооксидазы.

41 Биокаталитическое или продуктивное связывание Необходимым условием создания биосенсора является успешная иммобилизация фермента на поверхности трансдьюсера. При этом необходимо решить следующие задачи: прочно закрепить фермент, воспрепятствовав его смыванию в процессе анализа, стабилизировать фермент, а также обеспечить его высокую активность в иммобилизованном состоянии. Из множества подходов для решения этих задач приведем наш собственный способ, обеспечивающий создание наиболее прогрессивных биосенсоров с точки зрения их аналитических характеристик. Протокол иммобилизации ферментов в мембраны водонерастворимых полиэлектролитов включает экспонирование фермента водноорганической смеси с высоким (80–90%) содержанием органического растворителя.

42 2) Аффинное или непродуктивное связывание По аналогии с биокаталитическим распознаванием афинное взаимодействие можно представить в виде следующей схемы: E + S ES В природе существует несколько типов афинных взаимодействий. Наиболее распространено использование в анализе имунной реакции высших организмов. В ответ на попадание в организм чужеродных веществ (антигенов, Ag) начинается синтез антител (Ab) к этим веществам для их нейтрализации. Связывание антиген - антитело, как правило, прочное и избирательное. Элементы биологического узнавания (или распознавания) классифицируются по типу связывания с анализируемым веществом

43 Другим типом афинных взаимодействий, нашедшим широкое применение в биосенсорах, является связывание комплементарных молекул ДНК. Основная задача ДНК-сенсоров – это определение определенных последовательностей нуклеотидов для диагностики как наследственных заболеваний, так и опасных заражений организма. В недавнее время ДНК-сенсоры нашли применения в пищевой промышленности для выявления продуктов питания, приготовленных на основе генноинженерных растений. Лигандрецепторное взаимодействие, несмотря на надежды, связанные с ним еще 10 лет назад, используется в биосенсорах достаточно редко. В изолированном состоянии рецепторы, как правило, недостаточно стабильны, и их комплексы со специфическим лигандом недостаточно прочны. Однако существуют примеры использования рецепторов в составе целых клеток микроорганизмов. Основной проблемой создания биосенсоров на основе афинных взаимодействий является регистрация этого взаимодействия. В отличие от ферментативных реакций, афинные взаимодействия не приводят к образованию продуктов. Поэтому в подавляющем большинстве случаев как иммуносенсоры, так и ДНК-сенсоры требуют наличия различного типа меток (ферментативных, флуоресцентных, электрохимических, радиоактивных и пр.) и, как следствие, не являются безреагентными.

44 Существуют считанные трансдьюсеры, чувствительные к афинным взаимодействиям. Некоторые из них основаны на липидных бислоях, являющихся моделями биологических мембран. К сожалению, липидные бислои нестабильны в растворе, а при перенесении на твердую поверхность (электрод) они теряют мембранные свойства в связи с появлением большого числа дырок.

45 Элементы биологического узнавания (или распознавания) классифицируются по типу связывания с анализируемым веществом 3) Биологические надмолекулярные структуры Кроме индивидуальных биомолекул, в качестве биоузнающих элементов могут использоваться надмолекулярные структуры биологической природы. Формирование ответа таких структур может быть основано на использовании различных биохимических реакций, как биокаталитического, так и биоафинного типов.

46 Известно использование в биосенсорах полиферментных систем, обрывков биологических мембран, целых клеток микроорганизмов и тканей. Однако, пожалуй, наиболее ярким примером следует признать полевой транзистор на основе целого колорадского жука (рис. ).

47 БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ!