Модуль 6: Технология и процедуры Xpert MTB/RIF Слайды составлены по материалам Cepheid Глобальная лабораторная инициатива – Комплект учебных материалов. - презентация

1 Модуль 6: Технология и процедуры Xpert MTB/RIF Слайды составлены по материалам Cepheid Глобальная лабораторная инициатива – Комплект учебных материалов по Xpert MTB/RIF

2 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package Обзор технологии Подготовка образцов мокроты (нативных и обработанных) Подготовка внелёгочных образцов мокроты Процедуры анализа Xpert MTB/RIF Мониторинг процедуры

3 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package В конце данного модуля, Вы сможете: Описать технологию, которая лежит в основе GeneXpert и анализа Xpert MTB/RIF Объяснить процедуры анализа Xpert MTB/RIF Использовать программное обеспечение для мониторинга результатов исследований и генерирования отчетов

4 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package Комплексная микро-струйная система, состоящая из: Приборной платформы Картриджей (съемных) Автоматизированных протоколов Системы внутреннего контроля

5 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package GX-I GX-XVI GeneXpert Infinity-48 GeneXpert® Module GX-IIGX-IV

6 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package Поршневой двигатель Устройство для введения картриджей I-CORE Материнская плата Клапанный двигатель Ультразвуковой рожок

7 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package Приводной вал поршня Клапанный привод (скошенный) Ультразвуковой рожок ICORE модуль для помещения пробирок

8 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package Конец ручной работы Заполните картридж подготовленным образцом и вставьте его в прибор Образец подсоединяется к Регулятору обработки образца (SPC) Фильтр захватывает образец и SPC Клетки подвергаются лизису ультразвуком и выделяют ДНК Выделенные ДНК смешиваются с обезвоженными гранулированными реактивами Одновременная амплификация и выявление при помощи флуоресценции Результаты готовы менее, чем за 2 часа

9 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package Технологическая камера Камера содержит реактивы, праймеры, зонды, буферы и экстрагированный образец Позволяет выполнить экспресс-термическое циклирование и фотовозбуждение/выявлен ие Вращаясь, направляет жидкость в разные камеры и пробирку для ПЦР Пробирка для амплификации Корпус клапана Это автономная система

10 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -10- Пробирка для ПЦР Отверстия в корпусе клапана Шприцевая помпа Корпус картриджа Цилиндр шприца Поворотный клапан/Фильтр и зона для ультразвукового лизиса Колпачок/интерфейс для ультразвука Основание картриджа

11 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -11- ПЦР в режиме реальном времени (одновременная амплификация и выявление) Отсутствие влагообмена между инструментом и картриджем в целях исключения переноса материала Полностью внутреннее регулирование системы подачи реактивов – Нет необходимости во внешнем позитивном и негативном контроле Встроенный ультразвуковой лизис клеток для выделения ДНК Управляемые программным обеспечением материнские платы отдельных модулей для координации движений клапанов и встроенных гидравлических приводов Автоматизированная система регулирования потоков жидкостей – потоки жидкости направляются микро-клапанами – позволяет использовать микро-количества компонентов реакции Автоматизированный анализ данных и интерпретация результатов

12 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -12- Видеоролик находится по адресу Протокола передачи файлов (FTP): (ссылку следует скопировать и вставить в Windows Explorer, но не Internet Explorer) Видеоролики на FTP – это большие файлы, поэтому их следует загрузить на компакт-диск перед тренингом. В качестве альтернативы, можно получить доступ к видеоролику через Youtube: Видеоролик находится по адресу Протокола передачи файлов (FTP): (ссылку следует скопировать и вставить в Windows Explorer, но не Internet Explorer) Видеоролики на FTP – это большие файлы, поэтому их следует загрузить на компакт-диск перед тренингом. В качестве альтернативы, можно получить доступ к видеоролику через Youtube:

13 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -13- ДНК-мишень ПЦР Флуоресценция Выявление Этот слайд может считаться необязательным при обучении базовых пользователей Стадия амплификации ДНК при помощи ПЦР совмещена со стадией выявления Происходит амплификация ДНК- мишени, которая отмечается флуоресцентной меткой-зондом Накопленный продукт реакции контролируется и измеряется путем обнаружения флуоресценции Зонды, применяемые в технологии Xpert, называются «молекулярные маяки» Возможна амплификация и обнаружение нескольких мишеней (мультиплексный тест) Каждая мишень маркируется отдельным красителем

14 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -14- Этот слайд может считаться необязательным при обучении базовых пользователей Молекулярный маяк – это короткий сегмент однонитевой ДНК, состоящий из: Последовательности, характерной для мишени Ствола Флуоресцентного красителя Гасителя люминесценции

15 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -15- Молекулярный маяк Мишень Флуоресценция Нет флуоресценции Нет мишени = Нет флуоресценции Этот слайд может считаться необязательным при обучении базовых пользователей

16 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -16- Этот слайд может считаться необязательным при обучении базовых пользователей Мутации в гене rpoB, кодирующем β-субъединицу РНК- полимеразы предотвращает связывание рифампицина с полимеразой РНК, синтез протеинов и уничтожение бактерии 95% всей устойчивости к рифампицину являются результатом мутаций гена rpoB, а 5% формируется по причине мутаций вне гена > 90% мутаций гена rpoB расположены на участке 81 пар оснований (кодоны 507 – 533)

17 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -17- Этот слайд может считаться необязательным при обучении базовых пользователей 5 перекрещивающихся зондов связываются с генотипом дикого типа и не связываются с мутировавшими последовательностями 1 зонд для Контроля обработки образца - SPC (Bacillus globigii) В одновременном выявлении участвует всего 6 флуоресцентных красителей ФРАГМЕНТ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ К РИФАМПИЦИНУ В 81 п.о. ГЕНА rpoB

18 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -18- Этот слайд может считаться необязательным при обучении базовых пользователей Проверка наличия зонда (PCC) служит для проверки показаний флуоресценции до начала теплового циклирования химических веществ в картридже. PCC проверяет: Регидратацию реактива в гранулах Наполнение пробирки для ПЦР Целостность зондов Стабильность красителя или реактива/гасителя Результаты автоматически сравнивается в предустановленными заводскими настройками в программном обеспечении Исследование останавливается, если Проверка зонда не ПРОЙДЕНА

19 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -19- Этот слайд может считаться необязательным при обучении базовых пользователей Контроль обработки образца (SPC) Cостоит из неинфекционных спор Проверяет успешность лизиса клеток Выявляет замедление амплификации, связанной с образцом: должен быть положительным в отрицательных образцах и может быть отрицательным или положительным в положительных образцах Результат недействителен, если SPC отрицателен в отрицательном образце

20 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -20- Этот слайд может считаться необязательным при обучении базовых пользователей Проверка зонда Как минимум, 2 положительных зонда Нет значений Недействительный Ошибка Отрицательный Не выявлена устойчивость к RIF Выявлена устойчивость к RIF Выявлены МТБ Положительные зонды Остановка теста Да Нет Пройдена Не пройдена Все положительные 1 или более отрицательные Пол. Нет значений

21 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -21- Процедуры Xpert MTB/RIF

22 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package Смешать 2 Добавить 3 Вставить 4 Выявить

23 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package мл до указанной линии на дозаторе Налить реактив для образца (буфер) осторожно в образец, не допуская образования аэрозоля Не допускайте попадания каких-либо твердых частиц в смеси с образцом при переносе пипеткой в картридж Не допускайте образования пузырьков при переносе смеси с образцом в картридж 1. Добавить к образцу буфер для образца в соотношении 2:1 1. Добавить к образцу буфер для образца в соотношении 2:1 2. Встряхнуть, затем дать постоять 10 минут 3. Встряхнуть, затем дать постоять еще 5 минут 4. Перенести в картридж Начать тест…

24 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -24- Осторожно открутите крышку флакона с мокротой Налейте 2 объема реактива для мокроты (РМ) непосредственно в 1 объем мокроты во флакон с мокротой (1 мл мокроты – это минимальное количество, а оптимальным является 3-4 мл) Для большего объема образцов (более 4 мл), необходимо будет добавить РМ из второго флакона с реактивом, так как один флакон с реактивом рассчитан на 8 мл РМ Закройте крышку, энергично встряхните раз (при одном встряхивании, следует совершить движение назад и вперед) или воспользуйтесь встряхивателем (вортексом) Инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут После 10 минут инкубации, еще раз встряхните вручную (или при помощи встряхивателя) энергично раз После еще 5 минут инкубации, образец должен стать абсолютно жидким до исследования без видимых сгустков мокроты. Если он все еще вязкий, подождите еще 5-10 минут до его добавления в картридж (2-4 мл итогового раствора)

25 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package Add 1.5 ml of sample reagent (buffer) to 0.5 ml sediment (3:1 ratio) 1. Проведите посев и приготовьте мазок из осадка 2. Добавление 1,5 мл реактива для образца (буфера) к 0,5 мл осадка (соотношение 3:1) 3. Встряхнуть и дать отстояться 10 минут 4. Встряхнуть и дать отстояться еще 5 минут 5. Перенести 2 мл в картридж Начать тест…

26 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -26- Добавить 1,5 мл реактива для образца к 0,5 мл взвеси деконтаминированного, концентрированного осадка мокроты (Примечание: соотношение реагента к образцу 3:1) Закройте крышкой и энергично встряхните раз (при одном встряхивании, следует совершить движение назад и вперед) или воспользуйтесь встряхивателем (вортексом) Инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут После 10 минут инкубации, еще раз встряхните вручную (или при помощи встряхивателя) энергично раз После еще 5 минут инкубации, образец должен стать абсолютно жидким до исследования без видимых сгустков мокроты.

27 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -27- Адаптировать слайд, если когда-либо осуществляется разделение образцов

28 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -28- ВОЗ рекомендует использование следующих внелёгочных образцов для Xpert MTB/RIF Спинномозговая жидкость (СМЖ) Лимфоузлы и другие ткани (образцы должны быть подготовлены в БББ) Образцы СМЖ обычно содержат мало МБТ и могут быть подготовлены также как и образцы мокроты. Однако концентрация путём центрифугирования может обеспечить лучшие результаты. Использование БББ необходимо при открытии чашек центрифуги и слитии супернатанта. Образцы биологических жидкостей, полученные в закрытых шприцах должны быть подготовлены для анализа Xpert MTB/RIF в БББ. Выпускание содержимого шприца в 50 mL пробирку (типа Фалькон) может вызвать аэрозолизацию микобактерий. Процедуры безопасности по работе с острыми предметами должны соблюдаться. Образцы тканей при гомогенизации с использованием специального оборудования, также могут быть источником аэрозоля. Эти образцы также должны быть приготовлены в БББ. СОП доступен в Руководстве ВОЗ по использованию Xpert; Приложение

29 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -29- Лимфоузлы и ткани 1. Используя стерильные ножницы и пинцет расчлените образец ткани и поместите его в гомогенизатор (на рисунке) 2. Добавьте 2 мл раствора натрий фосфатного буфера (PBS) 3. Закройте гомогенизатор крышкой и растирайте до образования гомогенной суспензии 4. Дождитесь оседания крупных частиц (5-10 мин) 5. Поместите 0.7 мл супернатанта в коническую закручивающуюся пробирку (убедитесь, что частички ткани НЕ перенесены) 6. Добавьте 1.4 мл Xpert Реагента для образцов 7. Далее следуйте инструкциям по подготовке стандартного образца мокроты теста Xpert 8. Поместите в картридж 2+ мл мокроты 9. Проведите тест Xpert MTB/RIF Альтернативный протокол доступен в СОП ВОЗ для Нестерильных образцов. Деконтаминация данных образцов проводится как при подготовке образца из осадка центрифугированной мокроты. Рекомендуется проводить посев супернатанта гомогенизированной ткани. Требуется БББ

30 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -30- Образцы СМЖ (NB: наличие крови в образцах может негативно повлиять на проведение теста Xpert ) 1. образец СМЖ > 5 ml a) Перенесите в коническую центрифужную пробирку и центрифугируйте (3000g:15 min) b) Слейте супернатант в дез раствор (используя БББ) c) Добавьте Xpert MTB/RIF Реагент для образцов до 2 мл d) Добавьте концентрированный образец в картридж и проведите тест 2. образец СМЖ 1-5 ml (в т.ч. содержащие кровь ) a)Добавьте равный объём Xpert MTB/RIF реагента b)Добавьте 2 ml в картридж и проведите тест 3. образец СМЖ ml a)Добавьте 2 ml Реагента для образцов Xpert MTB/RIF b)Добавьте 2 ml в картридж и проведите тест 4. образец СМЖ

31 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -31- Подготовить за один раз количество образцов равное количеству имеющихся (т.е., исправных) модулей Начать подготовку образцов не более, чем за 4 часа до обеспечения наличия модуля Не открывайте крышку картриджа пока вы не будете готовы перенести в него образец; крышку следует закрыть сразу же после того, как добавлен образец.

32 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -32- Истек срок годности Он влажный Если сорвана пломба на крыше или крышка (случайно) открыта Его уронили или растрясли после добавления подготовленного образца Реакционная пробирка с задней стороны повреждена Он уже был использован: каждый картридж предназначен для одноразового использования и не может быть использован повторно после сканирования Упаковка (из 10 картриджей) была вскрыта более 6 недель назад

33 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -33- Картридж следует поднимать только взяв его с правой и левой стороны. Не трогайте крышку, штрих-код с передней стороны или реакционную пробирку с задней стороны Маркируйте картридж идентификационным номером образца, написав его с левой или правой стороны или прикрепите этикетку с идентификационным номером Не помещайте этикетку на крышке картриджа и не блокируйте нанесенный двухмерный штрих-код на картридже

34 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -34- Откройте картридж и пипеткой перенесите 2-4 мл подготовленного образца при помощи пластиковой пипетки для переноса жидкостей Пипеткой осторожно поместите образец в картридж, не допуская образования аэрозолей и пузырьков Не переносите твердые частицы в картридж Плотно закройте крышку Начните тест Отверстие картриджа для добавления образца Рис. 1 Картридж XpertMTB/RIF, вид сверху

35 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -35- Хранение образца: Прямая или обработанная (обеззараженная/концентрированная) мокрота Хранить в холодильнике при 2–8°C, максимум, в течение 10 дней При необходимости, хранить при комнатной температуре (до 35°C) до 3-х дней, а затем в холодильнике при 2–8°C, в целом, не более 10 дней Хранение образца с реактивом для образца: Прямая или обработанная (обеззараженная/концентрированная) мокрота Исследовать в течение 12 часов, хранить при 2-8°C. Если нет возможности хранить в холодильнике, исследовать в течение 5 часов. Хранение картриджей с посевом (например, при отключении электричества): Провести исследование в течение 4-х часов после добавления образца Если прошло более 4-х часов, осуществите посев в новый картридж

36 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package Включите прибор GeneXpert (на передней панели прибора загорится синяя лампочка) 2. Включите компьютер 3. Войдите в систему Windows как пользователь Cepheid:. Имя пользователя: Cepheid Пароль: cphd 4. Два раза щелкните курсором по иконке «GeneXpert Dx» на рабочем столе компьютера 5. Войдите в систему через учетную запись пользователя Windows 7 Windows XP

37 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package Нажмите «No» («Нет») в диалоговом окне «Database management» («Управление базой данных»), чтобы начать рабочую сессию.

38 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package Нажмите на «Check Status» («Проверка состояния») для подтверждения наличия модуля - Если его нет, перейдите к устранению проблем (Модуль 9)

39 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package Нажмите на «CREATE TEST» («СОЗДАТЬ ТЕСТ») 2. Откроется окно, где запрашивается сканирование штрих- кода картриджа

40 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package Возьмите считыватель штрих-кодов и просканируйте штрих-код картриджа, удерживая желтую кнопку. ПРИМЕЧАНИЕ: Если считыватель штрих-кодов не работает, вы можете ввести штрих-код картриджа вручную, набрав на клавиатуре 2 ряда цифр на картридже. После звукового сигнала «БИП», отодвиньте считыватель от картриджа, чтобы не сканировать один штрих-код дважды. В случае, если не сработает считыватель штрих-кодов при использовании новой партии, свяжитесь с отделом технической поддержки Cepheid для получения Параметров, характерных для партии

41 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package После сканирования штрих-кода, появится вот это окно 5. Введите ID данные пациента = Имя 6. Введите ID данные = Лабораторный серийный номер. По умолчанию, программное обеспечение показывает вид исследования, как «Specimen» («Образец»). Программа автоматически определяет модуль для использования (Примечание: выбирается модуль, который был использован меньше всего; вручную можно выбрать другой модуль) 7. Нажмите на «Start test» («Начать тест»)

42 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -42- Всегда держите картридж в вертикальном положении: не встряхивать, не наклонять, не ронять Полностью откройте дверцу отсека для картриджей выбранного модуля, на который указывает мигающий зеленый свет над выбранным модулем Осторожно загрузите картридж, при этом штрих-код должен находиться впереди Закройте дверцу отсека для картриджей, исследование начнется автоматически

43 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -43- Click on «Create Test» Scan cartridge barcode and click on «Manual Entry» Type manually the 2 line numbers of the cartridges Если считыватель штрих-кодов не работает, вы можете вручную ввести штрих-код картриджа Нажмите на «Create Test» («Создать тест») В диалоговом окне «Scan Cartridge Barcode» («Сканировать штрих-код картриджа»), нажмите на «Manual Entry» («Ручной ввод») Наберите на клавиатуре 2 ряда цифр на картридже

44 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -44- Видеоролик доступен по адресу Протокола для передачи файлов (FTP): (скопируйте и вставьте адрес в Windows Explorer, а не в Internet Explorer) Видеоролики FTP – это большие фацлы, поэтому их следует загрузить на компакт-диск до начала тренинга. Видеоролик доступен по адресу Протокола для передачи файлов (FTP): (скопируйте и вставьте адрес в Windows Explorer, а не в Internet Explorer) Видеоролики FTP – это большие фацлы, поэтому их следует загрузить на компакт-диск до начала тренинга.

45 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -45- В меню «Check status» («Проверить статус») (см. следующий слайд), убедитесь в том, что статус сменился с «loading» («загружается») на «run» («выполняется»), что означает начало исследования. Если вы хотите увидеть прогресс выполнения исследования, вы можете проверить: прогресс исследования (например, 3/45 означает, что исследование находится на третьем из 45 циклов ПЦР) количество времени, оставшееся до завершения исследования статус исследования (например, «OK») Если статус показывает «Error» («Ошибка») или «Warning» («Предупреждение»), просмотрите сообщения с описанием проблемы (см. следующий слайд).

46 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package Нажмите на « CHECK STATUS» («ПРОВЕРИТЬ СТАТУС») 2. Показаны прогресс, статус и оставшееся время 3. Сообщения с более подробной информацией

47 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -47- В случае неправильной подготовки картриджа(ей), вам, возможно, придется остановить исследование, чтобы не тратить зря время: 1. Нажмите на «STOP TEST» («ОСТАНОВИТЬ ИССЛЕДОВАНИЕ») 2. Выберите модуль(и), которые нужно остановить, отметив галочкой 3. После выбора модуля, нажмите на «Stop» («Остановить»)

48 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package Подтвердите ваш выбор, нажав «Yes» («Да») 5. Вы увидите детали остановленного исследования в разделе «Check Status» («Проверить статус»)

49 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -49- См. Модуль 7, где приводится информация на следующие темы: Визуальное отображение результатов исследования Редактирование информации об исследовании Генерирование отчета о результатах (образец и пациент) Как автоматически распечатать отчет Разница между архивированием/резервным копированием: как архивировать, найти и получить данные, создавать резервные копии и восстанавливать данные из резервных копий Как копировать/вставить данные в документ Excel

50 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -50- Анализатор Xpert MTB/RIF – это комплексная микро-струйная система, состоящая из прибора GeneXpert, картриджей Xpert MTB/RIF для исследований, автоматизированных протоколов (одновременной амплификации ДНК и обнаружение флуоресценции) и систем внутреннего контроля (Контроля обработки образца (SPC) и Проверка наличия зонда (PCC)) Протоколы подготовки образца должны выполнятся для нативной мокроты (2:1), Обработанного осадка мокроты (3:1), и внелёгочных образцов – в соответствии с протоколом следует корректировать меры биологической защиты Проверить целостность картриджей до использования, правильно маркировать и осуществлять посев в достаточном количестве (2-4 мл) итогового раствора После загрузки картриджей в прибор GeneXpert, сопутствующее программное обеспечение позволяет осуществлять мониторинг процесса.

51 Global Laboratory Initiative Xpert MTB/RIF Training Package -51- Перечислите и опишите разные компоненты технологии GeneXpert Перечислите и опишите разные системы контроля и их механизмы Опишите процедуру подготовки образца (в соответствии с исследуемым образцом) и последующие этапы создания и выполнения исследования Как вести мониторинг статуса исследования? Почему может возникнуть необходимость остановки исследования? Как это сделать?

52 Выражение признательности Комплект учебных материалов Xpert MTB/RIF был подготовлен со стороны консорциума партнеров в рамках Глобальной лабораторной инициативы (ГЛИ), включая FIND, KNCV, CDC США, ЮСАИД, TB CARE I и ВОЗ, при финансировании со стороны ЮСАИД. Модули основываются на материалах, которые были изначально разработаны со стороны FIND, KNCV и Cepheid. Перевод на русский язык осуществлён при поддержке FIND