Клинический анализ крови Кафедра лабораторной диагностики ЯГМА Речкина О.П. - презентация

1 Клинический анализ крови Кафедра лабораторной диагностики ЯГМА Речкина О.П.

2 Клинический анализ крови включает определение гемоглобина эритроцитов лейкоцитов подсчет лейкоцитарной формулы определение скорости оседания эритроцитов тромбоцитов.

3 Лабораторные методы исследования крови

4 Обеспечение высокого качества гематологических исследований возможно при стандартизации преаналитического и аналитического этапов работы. Преаналитические ошибки 68,2% Аналитические ошибки 13,3% Постаналитические ошибки 18,5%

5 Факторы влияющие на показатели крови физическая и эмоциональная нагрузка сезонные, климатические, метеорологические условия время суток прием пищи курение и т.д. возраст пол активность пациента и положение его тела в момент взятия крови. Показатели гемоглобина и гематокрита у больных в положении лежа снижены примерно на 6%. Выраженная диарея и рвота могут приводить к значительной дегидратации и гемоконцентрации.

6 Влияние суточных биоритмов на показатели крови костный мозг наиболее активен утром селезенка и лимфоузлы около 17 – 20 часов максимум гемоглобина в крови наблюдается с 11 до 13 часов, а минимум с 16 до 18 часов; эозинофилы наиболее низкие утром между 9 и 11 часами, пик эозинофилов наступает к 3 часам утра. Исследования крови необходимо производить (кроме экстренных случаев) в одно и тоже время для получения сопоставимых результатов

7 Взятие и подготовка материала для исследования Взятие крови На точность и правильность результатов оказывают влияние техника взятия крови, используемые при этом инструменты (иглы, скарификаторы и др.), пробирки, в которые осуществляется взятие, а в последующем происходит хранение и транспортировка. Стандартизация преаналитического этапа за счет использования стандартизированных коммерческих расходных материалов для взятия, хранения и транспортировки биопроб, стандартных реактивов и диагностических систем позволяют существенно повысить достоверность и точность исследования.

8 Кровь для общего клинического анализа берут из вены из пальца мочки уха у новорожденных - из пятки Исследование крови рекомендуется проводить утром натощак, до физической нагрузки и различных диагностических процедур, приема лекарственных препаратов, особенно вводимых парентерально.

9 Венозная кровь Оптимальным способом аспирации крови являются вакутейнеры (вакуумные системы взятия крови - Terumo, B&D): - содержат определенное строго дозированное количество антикоагулянта и обеспечивают стандартные условия аспирации всего объема крови - быстрое и качественное взятие крови пациента - сокращение времени взятия крови на 30 – 50% - кровь в пробирке не подвергается гемолизу - одной венопункции достаточно для отбора крови в несколько пробирок - отсутствует непосредственный контакт медицинской сестры или лаборанта с кровью больного, что обеспечивает профилактику вирусных инфекций, передающихся парентеральным путем.

10 Венозная кровь Взятие крови шприцом без антикоагулянта с последующим переливанием в пробирку недопустимо: контакт крови со стенками шприца ведет к образованию агрегатов тромбоцитов трудно соблюсти точное соотношение кровь/антикоагулянт давление в игле увеличивает вероятность гемолиза и разбрызгивания крови нарушение целостности и стерильности пробы - вероятность инфицирования персонала

11 Капиллярная кровь Для гематологических исследований капиллярную кровь рекомендуется брать в следующих случаях: - при ожогах - мелкие или труднодоступные вены - выраженное ожирение - склонность к венозному тромбозу - у новорожденных

12 Капиллярная кровь После прокола пальца несколько капель крови (не менее 3-4) спускают на индивидуальное предметное (часовое) стекло или гнездо пластикового планшета, перемешивают и используют для работы. Кровь набирают индивидуальным, стерильным капилляром Панченко, предварительно смоченным цитратом натрия. После прокола кожи пальца, 6-8 капель крови спускают в пластиковую пробирку с антикоагулянтом К 2 ЭДТА или К 3 ЭДТА (трилон Б) из расчета 1,5-2,2 мг на 1 мл крови, либо в специальные пластиковые пробирки одноразового пользования, обработанных К 2 ЭДТА (фир­ма "Deltalab", "Sarstedt", "Becton Dickinson" и др.). Сразу же после взятия пробу необходимо тщательно перемешать, перевернув пробирку крышкой вниз не менее 10 раз.

13 Антикоагулянт К 2 ЭДТА или К 3 ЭДТА (двух- или три калиевый этилендиаминтетраацетат или трилон Б) тринатрий-цитрат гепарин

14 ЭДТА - предпочтительный антикоагулянт при подсчете форменных элементов крови с использованием автоматических гематологических анализаторов. Концентрация ЭДТА во взятой крови должна быть постоянной и составлять 1,5 - 2,2 мг/мл крови (например, для получения соотношения 1,5 мг/мл в пробирку, рассчитанную на 2 мл крови, наливают 0,04 мл 7,5% раствора К2ЭДТА или К3ЭДТА). Недостаток антикоагулянта приводит к микро свертыванию крови и образованию сгустка, избыток - является причиной роста осмотического давления крови и сморщивания клеток. У некоторых пациентов может наблюдаться небольшая спонтанная агрегация тромбоцитов или реже, так называемая, ЭДТА-зависимая псевдо тромбоцитопения (иммунного характера). Использование Nа 2ЭДТА не рекомендуется вследствие его плохой растворимости в крови. Гепарин - лучший антикоагулянт для определения осмотической резистентности эритроцитов и функциональных исследований лейкоцитов, включая ряд тестов с иммунологическими маркерами. Особенностью действия этого антикоагулянта является способность максимально предотвращать гемолиз. Мазки, приготовленные из гепаринизированной крови и окрашенные по Романовскому, имеют голубоватый фон. Цитрат натрия - антикоагулянт выбора при исследованиях свертывающей системы крови и функции тромбоцитов. Применение в качестве антикоагулянтов гепарина или цитрата натрия сопровождается изменениями в структуре клеток и поэтому не рекомендуется для исследования морфологии клеток крови, кроме того, гепарин не предотвращает агрегацию клеток, поэтому его нецелесообразно использовать при подсчете лейкоцитов и тромбоцитов.

15 Доставка, хранение и подготовка проб к исследованию Исследование крови необходимо проводить либо непосредственно после взятия (исключается возможность спонтанной агрегации тромбоцитов), либо спустя 25 минут (время, необходимое для адаптации тромбоцитов к антикоагулянту) и не позднее 6 часов после взятия крови. При необходимости проведения отсроченного анализа (транспортировка на отдаленные расстояния, техническая неполадка прибора и т. д.), пробы крови хранят в холодильнике (4° - 8° С) и исследуют в течение 24 часов. Кровь нельзя замораживать. Исследование крови на приборе проводится при комнатной температуре. Кровь, хранившуюся в холодильнике, необходимо согреть до комнатной температуры, так как при низкой температуре увеличивается вязкость крови, и форменные элементы имеют тенденцию к склеиванию, что в свою очередь, приводит к нарушению перемешивания и неполному лизису. Исследование холодной крови может быть причиной флагирования при трехчленной дифференцировке лейкоцитов вследствие сжатия лейкоцитарной гистограммы. При выполнении гематологических исследований на значительном удалении от места взятия крови неизбежно возникают проблемы, связанные с неблагоприятными условиями транспортировки. Воздействие механических факторов (тряска, вибрация, перемешивание и т.д.), нарушения температурного режима, вероятность пролива и загрязнения проб могут оказывать влияние на качество анализов. Для устранения этих причин при перевозках пробирок с кровью рекомендуется использовать герметично закрытые пластиковые пробирки специальные транспортные изотермические контейнеры

16 Исследование содержания гемоглобина В крови гемоглобин существует в четырех основных формах: оксигемоглобин дезоксигемоглобин карбоксигемоглобин метгемоглобин.

17 Методы гемоглобинометр циан метгемоглобиновый метод Драбкина ( гемиглобинцианидный метод) гемоглобиновый метод (гемихромный метод) аммиачный метод

18 Гемиглобинцианидный метод (метод Драбкина) рекомендован Международным комитетом по стандартизации в гематологии в качестве референтного. В этом методе Fe ² гемоглобина окисляется до Fe ³ метгемоглобина. Метгемоглобин переводится в стабильный циан метгемоглобин цианидом. Гемиглобинцианидный метод характеризуется высокой точностью, простотой исполнения, дешевизной и возможностью выполнения на гематологических анализаторах. В настоящее время многие фирмы выпускают наборы реактивов для определения концентрации гемоглобина. Используя в качестве калибратора растворы гемиглобинцианида разной концентрации (НПО «Ренам», ЗАО «Медлакор», «Лахема» и др). Точные значения концентрации гемиглобинцианида и гемоглобина для каждой серии указаны в паспорте набора.

19 Гемихромный метод зарегистрирован МЗ РФ и рекомендован для применения в КДЛ. В отличие от гемиглобинцианидного метода не проводится перевод метгемоглобина в циан метгемоглобин, поэтому не используются цианистые соединения. Максимум поглощения гемохрома находится на длине волны 533 нм. Однако измерение на этой длине волны возможно только в спектрофотометрических приборах, где можно установить любую длину волны. На фотометрах используется длина волны в 540 нм, что в данном случае не совсем корректно

20 Аммиачный метод (модифицированный метод Дервиза-Воробьева) Метод также рекомендован МЗ РФ для использования в практике КДЛ. Сущность метода заключается в том, что все разновидности гемоглобина не переводятся в единую форму, а выполняется разведение пробы крови в 0,04% растворе аммиака. Этот метод реализован в гемоглобинометре «МиниГЕМ-523».

21 Факторы, влияющие на величину гемоглобина Скорость синтеза гемоглобина в эритрокариоцитах Объем плазмы (гиповолемия, гиперволемия)

22 Факторы, приводящие к ложно завышенным значениям гемоглобина Гиперлипидемия, WBC 100 х 109/л, наличие HbC или HbS, наличие легкопреципитирующих глобулинов (миеломная бень, бень Вальденстрема)

23 Значение параметров ОАК больного с ХМЛ с гиперлипидемией, полученные на двухх анализаторах АнализаторWBCRBCPLTHb, г/лMCV, флMCHC, % KX- 21(Sysmex) 299, 1 2, ,0378 Гемолюкс-19268, 3 2, ,4619

24 Контролем за правильностью определения гемоглобина может служить величина МСНС, которая рассчитывается приборами путем деления концентрации гемоглобина (в г/л) на гематокрит и умноженная на 100 Увеличение МСНС свидетельствует об ошибках при измерении пробы (погрешности определения гемоглобина или MCV)

25 Методы исследования эритроцитарных показателей

26 Эритроциты самая многочисленная популяция клеток крови. У взрослого человека в физиологических условиях: Число циркулирующих эритроцитов составляет около 2 л (кг) Длительность циркуляции – дней Диаметр 7-8 мкм, площадь поверхности –140 мкм 2, объем 90 мкм 3 (такую большую поверхность клетка имеет благодаря дискоидной двояковогнутой форме, которая совместно с высокой пластичностью и деформируемостью мембраны позволяет ей проходить через капилляры, проникать через стенки синусоидов, возвращаясь к исходным параметрам)

27 Эритроцит- безъядерная клетка, имеющая форму двояковогнутого диска с кольцеобразным утолщением по краям.

28 Функции эритроцитов участие в газообмене(благодаря его способности связывать кислород и углекислый газ) участие в гемостазе поддержание буферного ионно-водного равновесия участие в иммунном ответе транспорт аминокислот, липидов, токсинов участие в ферментативных процессах

29 Костный мозг пролиферирующий пул (проэритробласт, базоф.и полихромат. э/бласты); непролиферирующий пул ( оксифильный э/бл, ретикулоцит, эритроцит)

30 Факторы влияющие на правильность определения числа эритроцитов: Подготовка пациента Нарушения в технологии забора крови высокий лейкоцитоз гигантские тромбоциты агглютинация эритроцитов криоглобулинемия микроцитоз ( 36 фл )

31 Методы определения количества эритроцитов в крови. Подсчет количества эритроцитов в счетной камере Кондуктометрический метод ( м-д Культера)

32 Источниками ошибок при подсчете эритроцитов в счетной камере являются: Неточное взятие крови в пипетку. Образование сгустка, поглощающего часть клеток и занижающего результат исследования. Недостаточное перемешивание содержимого пробирки перед заполнением камеры. Неправильная подготовка камеры: недостаточное притирание покровных стекол; неравномерное заполнение камеры, образование пузырьков воздуха. Подсчет эритроцитов сразу после заполнения камеры, не выжидая 1 минуту. Подсчет меньшего, чем требуется по методике, количества квадратов. Плохо вымытые камера, пробирки, пипетка, капилляр для взятия крови; недостаточно просушенные пробирки и пипетки. Использование недоброкачественного разводящего раствора

33 Индексы эритроцитов В лабораторной и клинической практике используются различные индексы, позволяющие количественно характеризовать средний объем эритроцитов, степень их насыщения гемоглобином, анизоцитоз. Часть этих индексов можно рассчитать, исходя из концентрации гемоглобина, числа эритроцитов, показателя гематокрита, некоторые индексы определяют только автоматические гематологические анализаторы.

34 Цветовой показатель отражает относительное содержание гемоглобина в эритроците. Вычисляется цветовой показатель по формуле: ЦП = 3 хНВ(опыт)/ эритроциты (первые три цифры Цветовой показатель определяется в условных единицах и имеет отвлеченное значение. Нормальные величины - 0,86-1,05. В настоящее время значительно точнее и надежнее для оценки насыщения эритроцитов гемоглобином рассчитывать среднее содержание гемоглобина в эритроцитах.

35 Средний объем эритроцита ((MCV) Средний объем эритроцита (MCV) вычисляется путем деления гематокритной величины 1 мм 3 крови на число эритроцитов. Результат выражают в кубических микронах (мкм 3), или в фемтолитрах (фл). На практике средний объем эритроцита вычисляют путем умножения гематокрита (%) на 10 и деления полученного произведения на число эритроцитов в миллионах в кубическом миллиметре крови: Гематокрит (%) х 10 MCV=________________________________ Число эритроцитов (млн.кл./ мм 3) MCV является более объективным параметром, чем визуальная оценка диаметра эритроцитов. Нормальные величины: фл (мкм 3). Показатель MCV меняется в течение всей жизни: у новорожденных он достигает 128 фл, в течение первой недели снижается до уровня фл, к шести месяцам падает до 78 фл, к году составляет фл, в возрасте 4- 5 лет нижняя граница (80 фл) нормы стабилизируется. Снижение MCV менее 80 фл расценивается как мик- роцитоз, увеличение свыше 95 фл - как макроцитоз.

36 Среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН ) Среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН) устанавливается по формуле: Гемоглобин (г/л) мсн= _______________________________ Число эритроцитов (млн./мкл) Результат выражают в пикограммах (пг), норма составляет пг. Этот показатель характеризует среднее содержание гемоглобина в отдельном эритроците. Он аналогичен цветовому показателю. На основе этих индексов анемии разделяют на нормо-, гипо- и гиперхромные.

37 Средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС ) Средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС) вычисляется путем деления концентрации гемоглобина в г/100 мл на гематокрит и умножения на 100: Гемоглобин (г/дл) МСНС = _______________________________ х 100 Гематокрит (%) МСНС отражает насыщение эритроцита гемоглобином и в норме составляет г/дл. В отличие от МСН МСНС не зависит от клеточного объема и является чувствительным тестом при нарушениях процессов гемоглобинообразования. Предельная концентрация гемоглобина (38 г/дл) встречается редко.

38 Нормальные показатели количества эритроцитов Мужчины 4,0-5,0 х /л Женщины 3,9-4,7 дети 1 час 5,23-6,65 1 день 6,41-6,77 1 неделя 5,06-6,22 1 месяц 4,1-5,3 2 месяца 3,6-4,8 3-6 месяцев 3,7-4,8 1 год 3,8-4,72 15 лет 4,0-4,8

39 Морфология эритроцитов в мазке крови

40 Морфологические особенности эритроцитов при патологии Анизоцитоз – эритроциты разнообразной величины: Нормоцит - диаметр 7,1 -7,9 мкм Микроцит – диаметр < 6.5 мкм - микроцитоз Макроцит – диаметр > 8 мкм - макроцитоз Мегалоцит – диаметр >12 мкм Шизоциты (оторванные частицы эритроцитов) – диаметр 2-3 мкм Микросфероцит – уменьшение диаметра и увеличение толщины Пойкилоцитоз – изменение формы эритроцитов: Овалоцит – эритроцит овальной формы Акантоциты – эритроцит звездчатой формы Стоматоциты – эритроцит с центральным просветлением в виде «полулуния» Дрепаноциты – серповидная форма эритроцитов Гипохромия - снижение содержания Нв в отдельных эритроцитах Гиперхромия – увеличение толщины эритроцита, без повышения насыщения их Нв Полихроматофилия – недостаточное накопление Нв в эритроцитах с остатком базофильной субстанции

41 Гипохромия, анизоцитоз

42 Микросфероцитоз

43 Наследственный овалоцитоз

44 Наследственный стоматоцитоз

45 Акантоцитоз

46 Талассемия (мешеневидные эритроциты, анизо-, пойкилоцитоз

47 Серповидноклеточная анемия

48 Механический гемолиз Шлемовидные эритроциты

49 Макроцитоз, пойкилоцитоз, анизоцитоз, гиперхромия

50 Гематокрит (показатель гематокрита) Гематокрит (НСТ, Ht - hematocrit, гематокритная величина) отражает долю объема крови, занимаемую эритроцитами; выражается в процентах или в виде индекса в системе СИ (л/л). Наиболее распространен способ центрифугирования образца крови с добавлением антикоагулянта в стандартном капилляре с использованием гематокритных центрифуг и измерение высоты столбика эритроцитов. Наиболее удобны в использовании коммерческие гепаринизированные и негепаринизированные гематокритные капилляры (Deltalab) стандартов 75 мм, 70 мм и 30 мм. В большинстве гематологических анализаторов предусмотрено определение гематокрита

51 Клиническое значение. Показатель гематокрита широко используют для суждения о степени анемии, при которой, как правило, отмечается его снижение, иногда до значительных цифр (20-25%). Повышение гематокрита (55-65 % и выше) характерно для эритремии, менее резкое увеличение (50-55%) наблюдается при симптоматических эритроцитозах, сопутствующих врожденным порокам сердца, легочной недостаточности, некоторым гемоглобинопатиям. Показатель гематокрита дает представление о гемоконцентрационных сдвигах, он снижается при гемодилюции. Широко используется определение гематокрита для расчета эритроцитарных индексов, отражающих различные характеристики эритроцитов: средний объем, средняя концентрация гемоглобина, а также для ряда биохимических показателей. Гематокрит отражает лишь объем эритроцитов в крови, а не их общую массу в организме. Например, у пациентов с шоком за счет гемоконцентрации гематокрит может быть нормальным или даже высоким, хотя общая масса эритроцитов значительно снижена в связи с потерей крови. Гематокрит не может быть надежным параметром при оценке степени выраженности анемии сразу после потери крови или гемотрансфузии.

52 Основные источники ошибок при определении гематокрита несоответствующая концентрация антикоагулянта недостаточное перемешивание образца или малое угловое ускорение при центрифугировании наличие патологических форм эритроцитов (сфероцитов, овалоцитов).

53 Подсчет количества лейкоцитов

54 Факторы, влияющие на правильность исследования лейкоцитов криоглобулинемия парапротеинемия нормобласты агрегаты тромбоцитов нелизированные эритроциты длительное хранение крови при комнатной температуре

55 Нормы содержания лейкоцитов в крови Возраст Количество лейкоцитов 1 день неделя месяц 7.6 – год Взрослые 4.0 – 9.0

56 Методы определения количества лейкоцитов в крови. Подсчет количества лейкоцитов в счетной камере Подсчет лейкоцитов в гематологических анализаторах

57 Определение количества лейкоцитов в счетной камере. Подсчет лейкоцитов под микроскопом проводят после лизирования эритроцитов в 100 больших квадратах счетной сетки и пересчитывают на 1 л крови, исходя из объема квадратов и разведения крови. Подсчет лейкоцитов должен быть произведен в течение 2-4 ч после взятия крови.

58 При наличии в периферической крови ядросодержащих клеток красного ряд, они не лизируются и подсчитываются вместе с лейкоцитами. В этом случае, чтобы определить истинное количество лейкоцитов, из общего числа посчитанных клеток вычитают количество клеток красного ряда. Например: Общее количество лейкоцитов при подсчете в камере (или на анализаторе) -45 х 109/л. При подсчете лейкоцитарной формулы найдено, что на 100 лейкоцитов присутствует 50 эритробластов (нормобластов). Рассчитываем истинное количество лейкоцитов в крови: 150 клеток - 45 х 109/л 100 клеток (лейкоциты) - X Х =100*45*10/л /150 = 30*10/л Таким образом, истинное число лейкоцитов в крови составляет 30 х 109/л.

59 Основные источники ошибок при подсчете лейкоцитов в камере: Неправильное соотношение объемов крови и уксусной кислоты, взятых в пробирку. Неправильно подготовленный раствор уксусной кислоты (при концентрации большей, чем 5%, часть лейкоцитов может лизироваться, что приведет к занижению результата). Длительное нахождение пробы при температуре выше 28°С, что может ускорить лизис лейкоцитов в образце и привести к занижению результата. Неправильное заполнение камеры Горяева. Как и при подсчете эритроцитов, камеру необходимо оставлять на 1 минуту для оседания клеток. Недостаточно хорошо отмытая после предыдущего определения камера Горяева. Оставшиеся в камере лейкоциты могут завышать результаты анализа.

60 Гранулоцитопоэз (миелобласт, промиелоцит, миелоцит, метамиелоцит, палочкоядерный нейтрофил, сегментоядерный нейтрофил )

61 Морфология базофилов, моноцитов, эозинофилов, лимфоцитов

62 Подсчет количества тромбоцитов Методы подсчета тромбоцитов в счетной камере мазках крови гематологическом анализаторе Каждая группа методов имеет преимущества и недостатки. Подсчет тромбоцитов в камере достаточно точен, не требует для расчета количества эритроцитов. С другой стороны этот метод более трудоемкий, поскольку тромбоциты в нативном виде представлены мелкими и плохо контрастированными элементами. Недостаток метода - подсчет тромбоцитов в ближайшие часы после взятия крови. Определение количества тромбоцитов в мазках крови значительно уступает по своей точности камерному методу или автоматическим счетчикам. Ошибки при подсчете в мазках крови могут быть обусловлены плохим качеством мазка и связанным с этим неравномерным распределением тромбоцитов, неточным определением количества эритроцитов крови. Существенное неудобство метода - необходимость одновременного подсчета тромбоцитов и эритроцитов в крови. Преимущество его - возможность исследования тромбоцитов в любое время, независимо от момента взятия крови. Метод определения тромбоцитов с помощью гематологического анализатора позволяет достаточно точно определить количество тромбоцитов, их средний объем и распределение по объему.

63 Морфологическое исследование мазков крови

64 Техника приготовления мазка на предметном стекле Используются чистые предметные обезжиренные стекла желательно толщиной 1 мм (фирма «Гем»). Капля крови помещается в середине стекла в 1-2 см от одного из концов. Шлифованное стекло, которым будет сделан мазок, ставят на предметное стекло под углом градусов на 1-2 мм перед каплей и двигают его немного назад, чтобы стекло соприкоснулось с каплей крови и капля растеклась по углу между двухмя стеклами. Далее быстро проводят движение вперед по предметному шлифованным стеклом, которое должно быть уже предметного или специальным пластиковым шпателем (фирма "Гем", «А/О ЮНИМЕД»), позволяющим получить монослойный мазок практически на всем его протяжении. Мазок должен иметь длину 3-4 см. Не следует сильно нажимать на стекло, так как при этом травмируются форменные элементы крови. Мазки высушивают на воздухе и маркируют.

65 Техника приготовления мазка на предметном стекле Правильно выполненный высохший мазок должен быть тонким, желтоватого цвета, располагаться на 1-1,5 см от краев и оканчиваться «метелочкой». В толстых (густо-розового цвета) мазках морфология клеток плохо различима. После окрашивания эритроциты при микроскопии должны располагаться отдельно друг от друга в виде монослоя. Существует 2 типа автоматических приборов для производства равномерных мазков крови, в основе которых используется механическое распределение клеток или центрифугирование (Cytospin фирмы Shandon). Цитоцентрифуга концентрирует клетки на небольшой площади и такие мазки используют для изучения клеток в низких концентрациях, например, в спинномозговой жидкости. В современных гематологических анализаторах имеется устройство для автоматического приготовления мазков с последующей их фиксацией и окрашиванием, что еще больше сокращает время приготовления препаратов и обеспечивает постоянство характеристик окраски. Данные приборы требуют стандартных стекол размером 26x76x1 (фирма «Гем)

66 Окраска мазков крови Наиболее часто применяют окраску по Романовском по Нохту по Паппенгейму-Крюкову Существуют автоматические устройства для приготовления и окраски мазков, которые позволяют стандартизировать условия и повысить качество препаратов.

67 В настоящее время предлагается широкий спектр высококачественных красителей (фирма "Гем", НПФ "Абрис+"), удобные в применении и дающие хорошие результаты при окраске мазков. Можно использовать наборы для быстрого окрашивания мазков крови в течение секунд (фирма "Гем"). Автоматическая фиксация и окраска мазков может быть осуществлена с помощью специальных устройств: "Гема-Тек" (США), "ПОМК-1" (Россия), в которые загружают нефиксированные мазки. Последующее автоматическое дозирование фиксатора- красителя и буферных растворов обеспечивает стандартную и равномерную окраску мазков.

68 Исследование мазка крови. Окрашенный препарат крови должен сначала быть просмотрен с помощью иммерсионного объектива (90 х) и окуляра 7 х или 10 х. Использование ЮОх увеличения позволяет оценить соответствующее клеточное распределение, ориентировочное количество лейкоцитов в мазке. При исследовании эритроцитов важно выявить отклонения в их размере, форме, степени насыщения и распределении гемоглобина, а также наличие включений. Затем оценивается число и морфология тромбоцитов, а также морфология и дифференциальный подсчет лейкоцитов.

69 Дифференциальный подсчет лейкоцитов Подсчет лейкоцитарной формулы заключается в регистрации всех встречающихся в поле зрения лейкоцитов раздельно по их принадлежности к тем или иным росткам. В мазке крови распределение форменных элементов происходит неравномерно, так как лейкоциты различаются по своим физическим свойствам (размеры, удельная масса, упругость и т.д.). По краям препарата чаще встречаются нейтрофилы, моноциты, эозинофилы, в середине - лимфоциты. Поэтому передвигать стекло надо в определенном порядке. Считают несколько полей зрения вдоль края, затем возвращаются к центру и так далее по зубчатой траектории. При подсчете лейкоцитарной формулы используют лабораторные клавишные счетчики. Подсчитывают 100 клеток с последующим выведением процентного, а при необходимости абсолютного количества клеток, исходя из общего количества лейкоцитов. В случае патологии анализируют не менее 200 клеток, при этом особое внимание обращают на качественные изменения в эритроцитах, тромбоцитах и морфологию лейкоцитов.

70 При визуальном дифференциальном подсчете имеются 3 главных источника ошибок: неравномерное распределение клеток в препарате, нераспознавание клеток статистика. В обычном мазке лейкоциты в большем количестве располагаются в области "щеточки" и по краям препарата, а не в центре. Кроме того, там же располагаются и самые крупные клетки. Плохо приготовленный или плохо фиксированный и окрашенный мазок - основная причина ошибок, связанных с распознаванием клеток. Наибольшие ошибки, однако, встречаются в связи с тем, что подсчитывается малое количество клеток в образце.

71 Современные технологии гематологического анализа

72 В настоящее время для подсчета и анализа клеток крови используют гематологические анализаторы разного уровня сложности. Преимущество современных технологий подсчета и оценки форменных элементов крови: высокая производительность (до проб в час), небольшой объем крови для анализа ( мкл) анализ большого массива (десятки тысяч) клеток определение с высокой точностью и воспроизводимостью 20 и более параметров одновременно графическое представление результатов исследований (гистограммы, скетограммы). По сравнению с визуальной техникой автоматический подсчет более точный метод оценки концентрации клеток. Автоматизированный анализ крови открыл много новых диагностических возможностей, но одновременно он располагает и некоторыми ограничениями, особенно касающихся морфологических исследований клеток. Несмотря на все достоинства, даже самые современные анализаторы не в состоянии полностью заменить метод микроскопической оценки клеток.

73 Подготовка и проведение исследований на гематологических анализаторах При выполнении анализа на гематологическом анализаторе предпочтительно использовать венозную кровь. Взятие венозной крови лучше осуществлять, применяя специальные одноразовые системы с ЭДТА - «МОНОВЕТ». Это гарантирует отсутствие в образце посторонних примесей, а наличие антикоагулянта в оптимальной концентрации предотвращает образование фибриновых сгустков и агрегацию тромбоцитов. При взятии капиллярной крови оптимально использовать пробирки с ЭДТА - «МИКРОВЕТ». Нанесенный на внутреннюю поверхность пробирки мелкодисперсный порошок ЭДТА быстро растворяется в крови и надежно блокирует процессы свертывания крови и активации тромбоцитов. Не следует использовать пробирки с выпаренным раствором ЭДТА. При испарении раствора на дне пробирки образуются крупные кристаллы ЭДТА, которые очень медленно растворяются в крови. Это может приводить к образованию фибриновых нитей в верхней части пробы крови.

74 Не сдавливать палец пациента при взятии капиллярной крови и не накладывать жгут, либо ослаблять его сразу же после прокола вены при взятии венозной крови. Не забирать кровь со стекла. Цельная кровь имеет высокую вязкость и поэтому трудно перемешивается. Перед началом измерения цельную кровь следует перемешивать плавным переворачиванием и вращением пробирки в течение не менее 2 минут. Для этих целей лучше всего использовать специальный гематологический шейкер. При ручном перемешивании цельной крови недопустимы резкие встряхивающие движения, так как они приводят к механическому лизису эритроцитов.

75 Для дезинфекции подушечки пальца перед взятием крови и высушивания носика пробирки следует использовать специальные безворсовые салфетки. Помните, что применение ватных тампонов и других волокнистых материалов подобного рода приводит к засорению волокнами датчика подсчета клеток и гемоглобиновой камеры (для этого достаточно даже одного волокна!). В результате точность и воспроизводимость измерения концентрации гемоглобина резко падает. Извлечение посторонних частиц из камеры требует повышенного расхода промывающего раствора, а в ряде случаев, даже частичной разборки прибора. При работе в режиме предилюции следует учитывать, что образование пузырьков при разведении крови с использованием дилютора может приводить к лизису клеток крови и, как следствие, являться причиной завышения результатов подсчета тромбоцитов. Поэтому необходимо следить, чтобы жидкость стекала по стенке стаканчика без образования пузырьков.

76 Во избежание случаев несовместимости реагентов следует использовать изотонический раствор и гемолитик от одного изготовителя. При смене реагентов одного производителя на реагенты другого производителя обязательно консультируйтесь с инженерно-сервисной службой, так как может понадобиться перекалибровка прибора. При эксплуатации гематологических анализаторов важную роль играет качество электрической сети и заземления. Внезапное отключение электропитания часто приводит к сбоям в работе приборов и необходимости вмешательства инженеров сервисной службы. В том случае, если электрическое питание пропадает в момент забора пробы или анализа, и появляется спустя несколько часов (5 - 20), последствия могут оказаться просто плачевными - может выйти из строя гидравлика, засориться сгустками крови капиллярные трубки, апертура и т.д. Поэтому прибор должен работать с источником бесперебойного питания. Периодически необходима калибровка по стандартным материалам, так как электронные и механические компоненты прибора, датчиков, насосов и т.д. со временем подвергаются старению и меняют свои технические параметры. Для осуществления калибровки, необходимо пользоваться только качественными контрольными материалами!

77 Проточные гематологические анализаторы На основании количества определяемых параметров и степени сложности их можно условно разделить на 3 основных класса: I класс - полуавтоматические и автоматические счетчики клеток крови, позволяющие определять до 8-10 параметров, включая WBC, RBC, Hb, Ht, MCV, MCH, MCHC, PLT, MPV без дифференцировки лейкоцитов. II класс - автоматические гематологические анализаторы, определяющие до 20 параметров, включая расчетные показатели красной крови и тромбоцитов, гистограммы распределения лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов по объему, а так же частичную дифференцировку лейкоцитов на три популяции - лимфоциты, средние клетки и гранулоциты. III класс - высокотехнологичные гематологические анализаторы, позволяющие проводить развернутый анализ крови, включая полную дифференцировку лейкоцитов по 5-ти параметрам (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты и лимфоциты), гистограммы распределения лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов по объему, скетограммы. В основе работы анализаторов 1-го и 2-го классов лежит кондуктометрический метод. Анализаторы 3-го класса используют комбинации различных методов для подсчета клеток и дифференцировки лейкоцитов.

78 Кондуктометрические счетчики Технология автоматического подсчета клеток была разработана в 1947 г. Wallace H. и Joseph R. Coulter. Апертуро- импедансный метод (метод Культера или кондуктометрический метод) основан на подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клеток через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода. Если через узкий канал, заполненный электро­ проводящим раствором, проходит клетка крови, то в этот момент сопротивление электрическому току в канале слегка возрастает и хотя это изменение невелико, современные электронные приборы легко его улавливают. Каждое событие - прохождение клетки через канал, сопровождается появлением электрического импульса. Чтобы определить концентрацию клеток достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и сосчитать число электрических импульсов, которые при этом генерируются. Если в один момент в канале находятся две клетки, то все равно получается только один импульс, и это приведет к ошибке подсчета клеток. Во избежание этого, необходимо развести пробу крови до такой концентрации, при которой в канале датчика всегда будет не больше одной клетки.

79 Высокотехнологичные гематологические анализаторы Эти гематологические анализаторы способны осуществлять дифференцированный счет лейкоцитов по 5-ти основным категориям: нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты и лимфоциты. Кроме того данные приборы обладают системой "сигналов тревоги", предупреждающей оператора о наличии в исследуемых образцах крови патологических клеток. Принципы, положенные в основу пятичленной дифференцировки лейкоцитов, различаются у разных производителей.

80 Трехмерный анализ дифференцировки лейкоцитов - VCS VCS-технология является запатентованным методом дифференцировки лейкоцитов в анализаторах фирмы Bekman-Coulter (США-Франция). Технология VCS (Volume - Conductivity -Scatter) включает в себя одновременный компьютерный анализ клеток по трем направлениям: объем (Volume) электропроводность (Conductivity) дисперсия лазерного света (Scatter).

81 Основные характеристики, оцениваемые данным методом: Объем клеток определяется сопротивлением (импеданс) для тока низкой частоты

82 Величина и плотность внутренних структур клетки определяет электропроводность клеток для тока высокой частоты

83 Комбинированную информацию о размере клеток, ее гранулярности, поверхностной топографии несет отражение, поглощение и рассеивание лазерного луча

84 Полученные по трем каналам данные с помощью электроники комбинируются и анализируются, в результате чего происходит распределение клеток по дифференцировочным кластерам и, таким образом, лейкоциты разделяются на пять основных популяций: лимфоциты, моноциты, нейтрофилы, эозинофилы и базофилы.

85 Изменение дисперсии лазерного света клетками – MAPSS технология. В системах Cell-Dyn фирмы Abbot (США), Sysmex (SF 3000) для дифференцировки лейкрцитов применена технология MAPSS – мультипараметрическая система лазерного светорассеивания – регистрация интенсивности рассеивания клетками поляризованного лазерного луча под разными углами. Рассеивание клеткой поляризованного лазерного луча под разными углами дает сведения о таких ее свойствах как: размер клеток - для чего оценивается прохождение поляризованного лазерного луча под малым углом рассеивания (0°), структура и степень сложности клеток - оценивается по анализу рассеивания поляризованных лазерных лучей, направленных под углом до 7°, ядерно-цитоплазматическое соотношение - оценивается по анализу рассеивания поляризованных лазерных лучей, направленных под углом до 10°, оценка формы клеточного ядра - осуществляется благодаря анализу светорассеивания поляризованных лазерных лучей под углом 90°, для оценки клеточной зернистости и дифференцировки эозинофилов используется оценка светорассеивания деполяризованного луча под углом в 90°.

86 Измерение активности пероксидазы в лейкоцитах - PEROXchannel В приборах фирмы Bayer (Technicon серии Н, ADVIA) разработан принцип жидкостной цитохимии - реакции на пероксидазу. Использование данной реакции связано с различной активностью ее в лейкоцитах. Так, эозинофилы и нейтрофилы имеют интенсивную пероксидазную активность, моноциты - слабую, в лимфоцитах она не выявляется. Приборы одновременно измеряют абсорбцию и дисперсию видимого света.

87 Принцип дифференцировки лейкоцитов в анализаторах фирмы Texnicon. Пероксидазный канал Baso-канал

88 Принцип дифференцировки лейкоцитов в анализаторах фирмы Sysmex (SE-9000).

89 Основные показатели, получаемые с помощью гематологических анализаторов и факторы, влияющие на их значение WBC (white blood cells) - количество лейкоцитов крови (х 109/л). Коэффициент вариации (CV) при автоматическом определении этого показателя составляет 1-3%, в то время как при ручном подсчете 6,5-15% в зависимости от числа лейкоцитов. Измерение лейкоцитов проводится после полного лизиса эритроцитов в пробе. RBC (red blood cells) - количество эритроцитов крови (х 1012/л). Подсчет эритроцитов осуществляется в цельной крови (содержащей помимо эритроцитов еще и тромбоциты и лейкоциты). Поэтому измерению эритроцитов должно предшествовать соответствующее разведение крови для уменьшения интерференции со стороны лейкоцитов. Кроме того, при увеличении числа лейкоцитов ошибка оценки эритроцитов прогрессивно нарастает, при лейкоцитозе более 50 х 109/л может искажаться показатель объема эритроцитов (MCV). Коэффициент вариации для данного параметра составляет 1-2%, а для некоторых приборов - менее 1%.

90 HGB (hemoglobin) - концентрация гемоглобина (г/дл или г/л) в большинстве гематологических анализаторах определяется спектрофотометрически гемиглобинцианидным методом. Коэффициент вариации при этом не превышает 2%. НСТ (hematocrit) - гематокрит. В автоматических анализаторах крови НСТ представлен суммой прямо измеренных объемов эритроцитов в единице объема крови и проблемы "остаточной" плазмы не существует. Коэффициент вариации для автоматического метода - менее 1%, в сравнении с 1-2% при определении показателя методом центрифугирования.

91 MCV (mean corpuscular volume) - средний объем эритроцита, выражается в кубических мик­рометрах (мкм 3) или в фемтолитрах(1 фл = 1 мкм 3). MCV определяется большинством гематологических анализаторов благодаря прямой зависимости амплитуды электрического импульса от объема клетки. Вычисляется MCV делением суммы клеточных объемов на число эритроцитов. В то же время MCV - это средний показатель объема всей популяции клеток. Поэтому необходимо иметь в виду, что MCV может иметь нормальное значение при наличии у пациента одновременно выраженного макро- и микроцитоза. В этом случае особую диагностическую важность приобретает анализ гистограмм. МСН (mean corpuscular hemoglobin) - среднее содержание гемоглобина в эритроцитах (пг). Характеризует среднее содержание гемоглобина в отдельном эритроците в абсолютных единицах. Изменения МСН лежат в основе разделения анемий на нормо-, гипо- и гиперхромные. МСН - более объективный параметр, чем цветовой показатель, который не отражает синтез гемоглобина и его содержание в эритроците.

92 МСНС (mean corpuscular hemoglobin concentration) - средняя концентрация гемоглобина в эритроците (г/дл). Показатель МСНС отражает истинное насыщение эритроцита гемоглобином, поскольку величина среднего содержания гемоглобина в эритроците (МСН) зависит от объема клетки, а МСНС нет. Снижение значения МСНС наблюдается при заболеваниях, сопровождающихся нарушением синтеза гемоглобина. Увеличение же параметра МСНС выше нормальных значений свидетельствует об ошибках, допущенных при измерении данной пробы (погрешности определения гемоглобина или MCV), т.к. превышение концентрации гемоглобина выше определенного физиологического уровня привело бы к разрушению (гемолизу) эритроцитов, чего не наблюдалось в данной пробе. Таким образом, данный параметр может быть использован как индикатор ошибок, допущенных на аналитическом или преаналитическом этапах работы. RDW (red cell distribution width) - показатель гетерогенности эритроцитов по объему, характеризует степень анизоцитоза. RDW определяет величину колебания эритроцитов по объему, по этому параметру анизоцитоз улавливается прибором значительно быстрее, чем при визуальном просмотре мазка крови. Оценка степени анизоцитоза под микроскопом сопровождается целым рядом ошибок. При высыхании в мазках диаметр эритроцитов уменьшается на %. В толстых препаратах он меньше, чем в тонких. В то же время показатель RDW характеризует колебания объема клеток внутри популяции и не связан с абсолютной величиной объема эритроцитов. Поэтому при наличии в крови популяции эритроцитов с измененным, но достаточно однородным размером (например, микроциты), значения RDW могут быть в пределах нормы (11,5-14,5%).

93 PLT (platelet) - количество тромбоцитов (х 109/л). В отличие от ручного подсчета тромбоцитов, где проводится предварительный лизис эритроцитов, автоматические счетчики крови анализируют тромбоциты и эритроциты в одной камере без предварительной обработки. Это создает проблему дифференцирования больших форм тромбоцитов (макротромбоцитов) и сравнимых с ними по объему эритроцитов (микроцитов), их фрагментов (шизоцитов), а также отшнуровавшихся фрагментов цитоплазмы лейкоцитов (клеточный дебрис). MPV (mean platelet volume) - средний объем тромбоцитов выражается в фемтолитрах (фл) или мкм 3. В норме этот показатель варьирует от 7,4 до 10,4 фл и имеет тенденцию к увеличению с возрастом: с 8,6 - 8,9 фл у детей 1-5 лет до 9,5-10,6 фл у людей старше 70 лет. "Молодые" кровяные пластинки имеют больший объем, поэтому при ускорении тромбоцитопоэза средний объем тромбоцитов возрастает. Увеличение среднего объема тромбоцитов наблюдается при идиопатической тромбоцитопенической пурпуре, гипертиреозе, атеросклерозе, сахарном диабете, у курильщиков и лиц, страдающих алкоголизмом. Преходящая макротромбоцитемия описана у рабочих, контактирующих с асфальтовыми испарениями, лиц, работающих с ракетным топливом. Крупные тромбоциты с аномальной морфологией появляются при миелопролиферативных заболеваниях. Уменьшение этого показателя отмечается после спленэктомии и при синдроме Вискотта-Олдрича. В течение первых двухх часов после взятия крови с ЭДТА происходит набухание тромбоцитов с изменением их объема и соответственно увеличение MPV.

94 PDW (platelet distribution width) - ширина распределения тромбоцитов по объему измеряется в процентах (коэффициент вариации тромбоцитометрической кривой) и количественно отражает гетерогенность популяции этих клеток по размерам (степень анизоцитоза тромбоцитов). В норме этот показатель составляет 10-20%. Изменяется при миелопролиферативных заболеваниях. РСТ (platelet crit) - тромбокрит) является параметром, который отражает долю объема цельной крови, занимаемую тромбоцитами, выражается в процентах. В норме тромбокрит составляет 0,15-0,40%. Диагностическое значение этих тромбоцитарных индексов в настоящее время не определено

95 Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) В процессе оседания эритроцитов различают 3 фазы. В 1 фазе, под действием силы тяжести, эритроциты медленно оседают отдельными клетками. Через некоторый период времени они образуют агломераты, монетные столбики, оседание которых происходит значительно быстрее, чем единичных клеток. Агломерация эритроцитов является основным феноменом реакции оседания эритроцитов. В 3 фазе оседание вновь замедляется: агломераты эритроцитов располагаются так густо, что дальнейшее их оседание затруднено и постепенно прекращается. СОЭ меняется в зависимости от целого ряда физиологических и патологических факторов. Основным фактором, влияющим на образование монетных столбиков из эритроцитов, является белковый состав плазмы крови. Все белковые молекулы снижают Z-потенциал на эритроцитарной мембране, который способствует взаимному отталкиванию эритроцитов и поддержанию их во взвешенном состоянии. В нашей стране в практике КДЛ широко распространен микрометод Панченкова. Метод недорог и прост, но требует не менее 1 часа для выполнения, проводится вручную, кроме того, полученные результаты не могут быть автоматически документированы. В настоящее время по­мимо ручных методов определения СОЭ предлагается специальное оборудование, позволяющее ускорить и автоматизировать метод.

96 Методы определения СОЭ Микрометод Панченкова Автоматизированный метод

97 Клиническое значение определения СОЭ Увеличение СОЭ наблюдается при различных воспалительных процессах, интоксикациях, острых и хронических инфекциях, при инфаркте миокарда, опухолях, после кровопотери, оперативных вмешательств. При острых воспалительных и инфекционных процессах ускорение оседания эритроцитов наступает через 24 часа или через несколько дней после повышения температуры и увеличения числа лейкоцитов. Повышение белков острой фазы (фибриноген, С-реактивный белок, орозомукоид, альфа-1-антитрипсин, церулоплазмин и гаптоглобин), сопровождающее острый воспалительный процесс, способствует формированию агломератов эритроцитов и индуцируют повышение СОЭ. При хроническом воспалении увеличение СОЭ связано с повышением уровня фибриногена, моно- и поликлональных иммуноглобулинов в крови. СОЭ увеличивается при беременности, приеме многих стероидных гормонов (эстрогенов, глюкокортикоидов) и некоторых лекарственных препаратов (например, салицилаты). Особенно выраженное ускорение СОЭ (60-80 мм/ч) характерно для парапротеинемических гемобластозов (множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема, острый плазмобластный лейкоз и др.) и симптоматических парапротеинемий, сопутствующих злокачественным новообразованиям, хроническому гепатиту, циррозу печени, туберкулезу, амилоидозу, коллагенозам. Замедление СОЭ наблюдается при эритремии и симптоматических эритроцитозах. Измерение СОЭ рассматривают как предварительное исследование, которое не имеет выраженной специфичности для какого-либо заболевания и используется как скрининговый тест.

98 Ошибки при выполнении анализа на СОЭ могут быть связаны с различными факторами

99 При комнатной температуре СОЭ определяют не позже 2 часов после взятия крови. В случае хранения крови при +4°С, СОЭ определяют в течение не более 6 часов, но перед выполнением реакции кровь прогревают до комнатной температуры. Исследование СОЭ должно выполняться при 18-25°С. При более высоких температурах значение СОЭ увеличивается, при низких – замедляется. Перед проведением анализа кровь хорошо перемешивают, что обеспечит лучшую воспроизводимость результатов. При отсутствии резкой границы между эритроцитным столбиком и плазмой (регенеративных анемиях), над компактной массой эритроцитов образуется светлая «вуаль» в несколько миллиметров, из разведенных эритроцитов (главным образом из ретикулоцитов). В таком случае определяется граница компактного слоя, а эритроцитарная вуаль причисляется к столбику плазмы. Стеклянные капиллярные пипетки могут быть заменены на пластмассовые (полипропил, поликарбонат), однако они требуют проверки и оценки степени корреляции полученных результатов со стеклянными капиллярами. Нарушение соотношения кровь/цитрат (неточное дозирование цитрата или крови), стояние на свету, в тепле, более 4 часов с цитратом

100 РЕАКТИВНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ КРОВИ

101 Лейкоцитоз - увеличение содержания лейкоцитов в крови более 9,0 х 109/л. Лейкоцитоз может быть нейтрофильный, эозинофильный, моноцитарный, лимфоцитарный, редко вследствие увеличения другого вида клеток. Наиболее часто имеет место нейтрофильный лейкоцитоз или нейтрофилез, при котором абсолютное количество нейтрофилов превышает 6,0 х 109/л

102 Причины лейкоцитоза Лейкоцитоз может быть абсолютным и относительным Относительный или перераспределительный лейкоцитоз возникает вследствие сосудистых реакций с выселением лейкоцитов из кровяных депо: пищеварительный (особенно после белковой пищи), миогенный после мышечной работы или в результате судорог, симпатико-вегетативных воздействий - горячие и холодные ванны, эмоциональный фактор, беременность (смешанный характер лейкоцитоза)

103 Причины абсолютного лейкоцитоза

104 Абсолютный лейкоцитоз может быть функциональным и органическим Функциональный лейкоцитоз возникает вследствие стимуляции лейкопоэтической функции кроветворных органов в результате действия специфических возбудителей и факторов воспаления, носит временный характер: - Острые инфекционные процессы (кроме брюшного тифа, бруцеллеза, большинства вирусных инфекций) - Воспалительные заболевания (пневмония, плеврит и др.) - Гнойные процессы (сепсис,рожа, менингит и др) - Воздействие различных медикаментов – кортикостероидные препараты, интерлейкины, вакцины и сыворотки - Эндогенные интоксикации – инфаркт миокарда, обширные ожоги, Злокачественные опухоли, уремия - Экзогенные интоксикации – мышьяк, нитробензол, угарный газ и др - Воздействие ионизирующей радиации - Значительные кровопотери (особенно кровоизлияния в замкнутые полости) - Шоковые, послеоперационные состояния, эпилепсия Органический лейкоцитоз- острые и хронические гемобластозы

105 Причины лейкопении функциональные Нейро-вегетативные влияния (преоблпадание тонуса парасимпатической нервной системы,голодание, астноневротический синдром, во время глубокого сна, у стариков и истощенных лиц) Бактериальные инфекции (брюшной тиф, бруцеллез, затяжной септический эндокардит Вирусные инфекции – грипп, корь, краснуха, вирусный гепатит, Спленомегалия Системная красная волчанка органические Агранулоцитоз Гипо- и апластические состояния Некоторые гемобластозы Воздействие ионизирующей радиации

106 Нормальное содержание нейтрофилов Взрослые % Абсолютное количество *10 9 /л

107 Механизмы развития нейтрофилеза Усиленная продукция клеток в костном мозге Повышенная миграция клеток из костного мозга в кровь Перераспределение нейтрофилов из маргинального слоя в циркулирующий пул (демаргинация) Задержка миграции нейтрофилов из крови в ткани Сочетанное воздействие выше перечисленных причин

108 Усиленная продукция клеток в костном мозге – истинное увеличение числа циркулирующих нейтрофилов Как правило сопровождается омоложением ряда Острые бактериальные инфекции (пневмония, сепсис, остеомиелит вызванные: кокковой флорой – стафилококком, пневмококком, гонококком, некоторыми бациллами –E coli, C. diphtherie, P.tularenis, Инфекции, вызванные некоторыми грибами (Actinomyces), спирохетами, вирусами(бешенства, полиомиелита, опоясывающего лишая, оспы и ветряной оспы), риккетсиями(тиф) и паразитами (трематода) Локализованные воспалительные процессы (фурункул, карбункул, абсцесс, флегмона и др.)

109 Выраженность нейтрофильной реакции зависит от Вирулентности микроорганизма, Является инфекция локализованной или генерализованной Защитных способностей организма

110 Повышенная миграция клеток из костного мозга в кровь Часто сопровождается морфологическими аномалиями лейкоцитов Злокачественные новообразования (особенно в стадии распада, особенно опухоли печени, поджелудочной железы) Ожоги Тромбозы и инсульты Подагра Сывороточная болезнь Кетоацидоз Уремический перикардит Токсические воздействия - ртуть, СО, дигиталис, камфора, яды насекомых Кровотечения, особенно во внутренние полости (нарушенная внематочная беременность, субарахноидальные и др.)

111 Перераспределение нейтрофилов из маргинального слоя в циркулирующий пул (демаргинация) Не сопровождается омоложением лейкоцитарной формулы Физическая нагрузка Эмоциональная нагрузка Прием пищи Лекарственные препараты Воздействие холода, тепла, наркоза Судороги Пароксизмальная тахикардия Роды

112 Механизмы развития нейтропении Снижение продукции нейтрофилов в костном мозге Замедление выхода нейтрофильных гранулоцитов из костного мозга Повышенная деструкция нейтрофилов в сосудистом русле и уменьшение времени их циркуляции Перераспределение нейтрофилов в сосудистом русле

113 Снижение продукции нейтрофилов в костном мозге Происходит вследствие угнетающего воздействия бактериальных токсинов на нейтропоэз в результате активации макрофагов при вирусных и риккетсиозных инфекциях (брюшной тиф, паратифы, туляремия, подострый септический эндокардит, хрон. сепсис, милиарный туберкулез, тяж. течение инфекционных заболеваний, ОРВИ, грипп, вир. гепатит, сыпной тиф) При поражении стволовых клеток (апластические состояния, миелотоксический агранулоцитоз) Повышение супрессорной активности Т- лимфоцитов в отношении гемопоэза

114 Нейтропении ниже 1,5*10 9/л Приобретённые: при тяжёлых бактериальных инфекциях, при тяжёлых бактериальных инфекциях, вирусных инфекциях, вирусных инфекциях, химических отравлениях, химических отравлениях, опухолях, опухолях, цитостатической терапии, цитостатической терапии, аплазии кроветворения, аплазии кроветворения, остром лейкозе, остром лейкозе, аутоиммунных заболеваниях, аутоиммунных заболеваниях, иммунных лекарственных иммунных лекарственных

115 Средние клетки Это сумма эозинофилов, базофилов, моноцитов, плазмоцитов Эозинофилы 1-5%, абсолютное количество *10 9 /л базофилы 0 – 0.5 – 1%, абсолютные показатели -0,01-0,1*10 9 /л (0.042) Моноциты 6-8%, абсолютное количество *10 9 /л

116 Кинетика эозинофилов Зрелые эозинофилы выходят в сосудистое русло и циркулируют там до 10 часов, составляя 0,5% от всех лейкоцитов крови В тканях срок жизни эозинофилов около 6 суток. Тканевые эозинофилы распределены неравномерно, наибольшее их количество выявляется в тканях, соприкасающихся с внешней средой – подслизистый слой дыхательного пищеварительного и мочеполового тракта. Тканевые эозинофилы повторно в сосудистое русло не возвращаются и разрушаются путем апоптоза в тканях.

117 Гранулы эозинофилов Главный щелочной протеин – обладает цитотоксичностью, повреждает некоторые личинки гельминтов, эпителиальные ткани, нейтрализует гепарин Кислая фосфатаза Арилсульфатаза –ингибирует анафилактоидные вещества, уменьшая реакцию гиперчувствительности немедленного типа Простагландины – угнетают дегрануляцию тучных клеток Гистаминаза, фосфолипаза – инактивируют гистамин, гепарин, уменьшая последствия секреции тучных клеток Коллагеназа Эластаза Глюкоронидаза Эозинофильная пероксидаза – бактерицидная активность

118 Функции эозинофилов Эозинофил – основная эффекторная клетка в развитии инфекционных, паразитарных, аллергических, аутоиммунных и онкологических заболеваний

119 Нормы эозинофилов Периферическая кровь 1-5% Абсолютное количество *10 9 /л

120 Причины эозинофилии Инвазия паразитами Аскаридоз, трихинеллез, токсокароз, эхинококкоз, шистосоматоз, филяриатоз, стронгилоидоз, описторхоз, анкилостомидоз, лямблиоз Опухолевая пролиферация(повышенная продукция ИЛ-5) Лимфогранулематоз, острые и хр лейкозы, лимфомы, злокач. опухоли других локализаций, сопровождающиеся метастазами или некрозом Сенсибилизация организма Лекарственная аллергия, бронхиальная астма, алл. дерматиты, и др. Иммунодефициты Синдром Вискотта-Олдрича Патология соединительной ткани Узелковый периартериит, ревматоидный артрит, системная склеродермия, Инфекции Туберкулез, хламидийная пневмония Интерстициальные и др заболевания легких Саркоидоз, гистиоцитоз, Болезнь Леффлера (легочный эозинофильный инфильтрат)

121 Клинико-диагностическое значение эозинопении 1 фаза воспалительного процесса при тяжелых гнойных инфекциях Шок Стресс Эклампсия В периоде родов Интоксикация различными химическими соединениями, тяжелыми металлами

122 Базофилы Состав гранул (гепарин, гистамин, серотонин, гиалуроновая кислота, ферменты, лейкотриены, простагландины и др.) Высокой плотности рецепторы к IgЕ Синтез сульфатированных гликозаминогликанов, которые участвуют в образовании межклеточного вещества Функции: фагоцитоз, участие в аллергических реакциях, обеспечение нормальной структуры соединительной ткани

123 Функции базофилов Реакции, определяемые базофилами и тучными клетками, необходимы для формирования воспалительного процесса как главной реакции иммунной системы на чужеродные агенты IG E, секретируемые плазмоцитами, фиксируются на рецепторах тучных клеток. Такая фиксация может сохраняться годами и не сопровождаться активацией клеток (состояние, характетизующееся фиксацией Ig E к определенному аллергену, называется сенсибилизацией).

124 Функции базофилов При повторном поступлении аллергена, он фиксируется к спец Ig E, что ведет к активации клетки, слиянию мембран гранул с цитоплазматической мембраной и выбросу содержимого гранул наружу ( дегрануляция занимает несколько секунд и не приводит к гибели клетки). В тучных клетках возможен процесс восстановления гранул. Следствием этого процесса являются местная дилятация и повышение проницаемости сосудов, гиперемия и зуд, спазм гладкой мускулатуры бронхов, ЖКТ, гиперпродукция слизи, раздражение нервных окончаний, т.е. реакция гиперчувствительности немедленного типа.

125 Морфология базофилов Размер клетки мкм Ядро: расположение –центральное, форма- 2-3 сегмента (чаще фигура трефового туза), цвет ядра –лилово- синий, хроматин- грубый, закрыт гранулами. Цитоплазма – относительные размеры значительные, цвет - интенсивно розовый, гранулы большие, грубые, лиловые или синевато-черные

126 Нормы базофилов Периферическая кровь взрослого 0 – 0.5 – 1% Абсолютные показатели 0,01-0,1*10 9 /л (0.042) У новорожденных концентрация базофилов относительно больше, снижается до нормы взрослых на 5 день жизни Имеют суточный ритм –max ночью, min утром У женщин имеется месячный ритм - максимум перед началом кровотечения, минимум во время овуляции Увеличиваются во время postprandial lipemia – выброс гепарина, который активирует липазу

127 Клиническое значение базофилии (более 150/мкл) Эти клетки являются источником медиаторов, запускающих анафилактоидную реакцию немедленного типа, поэтому базофилия встречается при: аллергических реакциях, воспалительные процессы - ранняя фаза ревматизма, ревматоидный артрит, язвенный колит ХМПЗ (хроническом миелолейкозе, миелофиброзе, эритремии) вирусные заболевания - ветрянка, грипп хронические инфекции – туберкулез дефицит железа рак

128 Нормальное содержание лимфоцитов Взрослые – 4.2*10 9/л Дети до 9,0*10 9/л

129 ЛИМФОЦИТОЗ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ с 4-5 дней до 4-5 лет Патология в этом возрастном периоде при повышении лимфоцитов в формуле > 65%. с 4-5 дней до 4-5 лет Патология в этом возрастном периоде при повышении лимфоцитов в формуле > 65%.

130 Лимфопения – уровень лимфоцитов ниже 1,2*10 9/л на фоне лечения глюкокортикоидами на фоне лечения глюкокортикоидами СПИД СПИД лимфогрануломатоз, лимфосаркома лимфогрануломатоз, лимфосаркома хронические инфекции (туберкулёз, саркоидоз) хронические инфекции (туберкулёз, саркоидоз) диссеминированная системная красная волчанка диссеминированная системная красная волчанка

131 Пичины лимфоцитоза некоторые бактериальные инфекции (коклюш, иерсиниоз, феллиноз) некоторые бактериальные инфекции (коклюш, иерсиниоз, феллиноз) лимфотропные инфекционные заболевания (инфекционный мононуклеоз, инфекционный лимфоцитоз, цитомегаловирус, аденовирус) лимфотропные инфекционные заболевания (инфекционный мононуклеоз, инфекционный лимфоцитоз, цитомегаловирус, аденовирус) иммунокомплексные болезни (тиреотоксикоз, язвенный колит, болезнь Крона, васкулиты) иммунокомплексные болезни (тиреотоксикоз, язвенный колит, болезнь Крона, васкулиты) детские инфекции (ветряная оспа, скарлатина. краснуха, гепатит) детские инфекции (ветряная оспа, скарлатина. краснуха, гепатит)

132 Возрастные нормативы моноцитов: новорожденные 5-6% новорожденные 5-6% 1 неделя жизни 6-9% 1 неделя жизни 6-9% 6 месяцев – 6 лет 5-7% 6 месяцев – 6 лет 5-7% старше 6 лет 4-5% старше 6 лет 4-5%

133 МОНОЦИТОЗ – уровень моноцитов выше 0,8 · 10 9 /л инфекционный мононуклеоз инфекционный мононуклеоз иерсиниоз иерсиниоз коревая краснуха коревая краснуха туберкулёз туберкулёз хронические вялотекущие воспалительные процессы хронические вялотекущие воспалительные процессы спленэктомия спленэктомия моноцитарный лейкоз моноцитарный лейкоз