КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК 5. Культивирование микроорганизмов. - презентация

1 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК 5

2 Культивирование микроорганизмов

3 Основные источники получения микроорганизмов, используемых для культивирования. 1. Классический путь – проводится выделение микроорганизмов из мест, где обитание того или иного вида наиболее вероятно. В элективных средах путем варьирования различных факторов создаются избирательные условия для преимущественного развития определенного микроорганизма. Таким образом получают накопительные культуры микроорганизмов. Следующий этап – выделение чистых культур. Для этого используют плотные питательные среды, на которые засевают образцы проб из накопительных культур. Отдельные клетки микроорганизмов на плотных питательных средах образуют изолированные колонии, при их последующем пересеве получаются чистые культуры продуцента. 2. Другой путь подбора микроорганизмов – из имеющихся коллекций микроорганизмов.

4 Получение накопительных культур Выделение чистой культуры данного микроорганизма будет успешным, если он присутствует в смешанной популяции в достаточно высокой концентрации, т. е. количественно преобладает. Разработанные методы накопления имеют целью добиться увеличения относительного количества данного организма благодаря созданию лучших условий для его роста и выживания по сравнению с другими или путем пространственного отделения его от других членов популяции. К физическим методам накопления следует относить регуляцию роста температурой, тепловую и ультразвуковую обработку, ультрафиолетовое облучение, приводящие к гибели или подавлению роста других организмов, присутствующих в популяции, но существенно не затрагивающие выделяемые клетки.

5 Можно также использовать преимущества в некоторых физических свойствах изучаемого микроорганизма, таких, как его размеры и подвижность; это позволяет в значительной мере отделить данный организм от других в популяции. В основе действия химических методов лежит использование токсичных веществ, которые подавляют рост оставшейся части популяции, не оказывая влияния на выделяемый микроорганизм. Кроме того, это могут быть вещества, служащие источниками питания, используемыми преимущественно отдельными микроорганизмами в смешанной популяции. Биологические методы включают использование специфических хозяев для выделяемого организма, а также преимуществ некоторых патогенных свойств микроорганизма (например, его инвазивность), которыми не обладают другие представители популяции. Во многих случаях для получения максимального эффекта накопления сочетают физические, химические и биологические методы. Как правило, накопительные культуры получают в закрытых системах, т. е. микроорганизмы выращивают в обычных периодических (стационарных) условиях на чашках Петри, в колбах или пробирках, где в среде культивирования концентрация питательных веществ и продуктов метаболизма постоянно изменяется в процессе роста клеток.

6 Получение чистых культур Из накопительных культур микроорганизмы обычно выделяют путем их пространственного отделения от других форм на твердой среде, где они растут в виде колоний. Для микроорганизмов, не растущих на твердых средах, можно использовать метод предельного разведения, последовательно перенося клетки в отдельные пробирки с жидкой средой. Для выделения микроорганизмов в виде чистых культур известно сравнительно мало методов. Чаще всего используют способ изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде или метод предельных разведений. Однако получение отдельной колонии не всегда гарантирует чистоту культуры, поскольку колонии могут вырасти не только из отдельных клеток, но из их скоплений. Для выделения предпочтительнее использовать неселективную среду, поскольку на ней лучше растут контаминирующие микроорганизмы и их легче обнаружить. Не следует очень быстро отбирать колонии, поскольку за данный отрезок времени могут не вырасти медленно растущие контаминирующие организмы.

7 Чистые культуры Из чистой культуры обычно вырастают одинаковые колонии, и при микроскопировании выявляются схожие клетки, в частности, по морфологии и результатам окраски по методу К. Грама. Однако возможны исключения, например, колонии, вырастающие из чистой культуры, могут быть гладкие (S) и шероховатые (Р). Кроме того, в чистых культурах различных микроорганизмов могут появиться морфологически различные клетки (полиморфизм), цисты и споры. Наконец, некоторые микроорганизмы проявляют грам вариабельность. Тем не менее, указанные критерии широко используются при определении чистоты культур.

8 Определение чистоты культуры При определении чистоты культуры учитывают морфологию колоний, формирующихся на плотных питательных средах, оценивая следующие признаки: профиль – плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный и т.д.; форму – округлая, амебовидная, неправильная, ризоидная и т.д.; размер (диаметр) – измеряют в миллиметрах; если размеры колонии не превышают 1 мм, то их называют точечными; поверхность – гладкая, шероховатая, бороздчатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная; блеск и прозрачность – колония блестящая, матовая, тусклая, мучнистая, прозрачная; цвет – бесцветная (грязно-белые колонии относят к бесцветным) или пигментированная; особо отмечают выделение в субстрат пигмента;

9 край – ровный, волнистый, зубчатый, лопастной, ризоидный, бахромчатый и т.д.; структуру – однородная, мелко- или крупнозернистая, струйчатая и т.д.; консистенцию: колония может легко сниматься с агара, быть плотной, мягкой или врастающей в агар, маслянистой, слизистой (прилипает к петле), вязкой, пленчатой (снимается целиком), быть хрупкой (легко ломается при прикосновении петлей). Размеры и многие другие особенности колонии могут изменяться с возрастом и зависят от состава среды. Поэтому при их описании указывают возраст культуры, состав среды и температуру культивирования.

10 Рис. Форма колонии 1 – круглая; 2 – круглая с фестончатым краем; 3 – круглая с валиком по краю; 4, 5 – ризоидные; 6 – с ризоидным краем; 7 – амебовидная; 8 – нитевидная; 9 – складчатая; 10 – неправильная; 11 – концентрическая; 12 – сложная

11

12 Рис. Профиль колонии 1 – изогнутый; 2 – кратерообразный; 3 – бугристый; 4 – врастающий в субстрат; 5 – плоский; 6 – выпуклый; 7 – каплевидный; 8 – конусовидный

13 Рис. Край колонии 1 – гладкий; 2 – волнистый; 3 – зубчатый; 4 – лопастной; 5 – неправильный; 6 – реснитчатый; 7 – нитчатый; 8 – ворсинчатый; 9 – ветвистый

14 Рис. Структура колонии 1 – однородная; 2 – мелкозернистая; 3 – крупнозернистая; 4 – струйчатая; 5 – волокнистая

15 Рис. Колонии дрожжей разных видов на сусло-агаре

16 Haemophilus influenzae

17 Рис. Культура дрожжевого гриба Candida albicans

18

19 Рис. Колонии мицелиальных грибов

20

21 Классификация процессов культивирования Выбор процесса культивирования зависит не только от потребностей организма, но и от того, для чего будет использована культура, то есть, от конечной цели эксперимента. 1)по состоянию питательной среды или по основной фазе (поверхностные и глубинные); 2)по наличию или отсутствию перемешивания (динамические или статические); 3)по содержанию кислорода (на аэробные или анаэробные); 4)по способу действия (закрытые, чаще периодические, и открытые, чаще непрерывные); 5) по количеству ферментеров (одно-, двух- и многостадийные); 6) по способу управления (хемостатные, турбидостатные, оксистатные, рН-статные и другие); 7) по степени защищенности от посторонней микрофлоры; 8) по числу видов микроорганизмов.

22 Рис. Основные методы культивирования микроорганизмов.

23 Культивирование микроорганизмов на твердой поверхности Культура бактерий на твердой среде имеет ряд преимуществ: 1. В случае культур, выращенных на твердой среде, нет необходимости использовать оборудование для сбора клеток, поскольку в этих культурах клетки находятся уже в сконцентрированном состоянии. 2. Твердые культуры относительно свободны от макромолекулярных компонентов и полностью свободны от частиц питательной среды, так как последние обычно находятся внутри агарового геля. Более того, твердые культуры относительно свободны от низкомолекулярных питательных веществ и продуктов метаболизма микроорганизмов. 3. На твердых средах можно получать результаты, которые невозможно достичь другим путем.

24 Недостатки твердых культур 1. Твердая культура имеет ограничения при выращивании больших количеств биомассы. 2. Твердые культуры не обеспечивают однородность популяции клеток, т. е. культура гетерогенна в физиологическом отношении. Гетерогенна культура и в техническом смысле, так как клетки микроорганизмов и питательная среда распределены неравномерно. 3. Твердые культуры характеризуются небольшим числом клеток в пересчете на данное количество среды.

25 Твердофазное культивирование Используется в основном для культивирования грибов. В качестве твердой фазы могут выступать различные виды растительного сырья. 1. Дешевое производство и возможность использования субстратов, которые непригодны для других способов культивирования. 2. Некоторые процессы протекают значительно интенсивнее. Варианты твердофазного культивирования: 1. Поверхностное («тонкий слой»), 2. Глубинное в неперемешиваемом слое («высокий слой»), 3. Культивирование в перемешиваемой и аэрируемой массе.

26 Преимуществами такого способа культивирования являются простота конструкций биореакторов (растильных, или бродильных, камер), систем подачи воздуха и регулирования температурно-влажностного режима. К недостатком относят низкую эффективность использования субстрата и продуктивность; сложность механизации и автоматизации процесса культивирования, стерилизации, загрузки-разгрузки лотков и кювет; не стерильность процесса.

27 Рис. Аппарат Шуценбаха: 1 деревянная коническая ёмкость; 2 слой буковых стружек

28 Рис. 2. Аппарат Фрингса: 1 корпус; 2 ложное перфорированное днище; 3 слой буковых стружек; 4 циркуляционный насос; 5 змеевик системы термостатирования; 6 распределительное устройство стружек.

29 ферментёры для производства уксуса

30 В поверхностных твердофазных процессах роль биореакторов выполняют большие, площадью до нескольких кв. метров, лотки (или подносы) из алюминия или культивационные камеры. При твердофазной ферментации процесс протекает в вентилируемых растильных (бродильных) камерах с регулируемым температурно-влажностным режимом, в которых на стеллажах размещают лотки с твердой средой. Для лучшей аэрации среды подаваемый в камеру воздух проходит через перфорированное днище лотков. В большинстве твердофазных процессов отсутствует перемешивание, рост микроорганизмов происходит по принципу колонизации: по мере размножения они распространяются из точек внесения в субстрат по всему его объему. При этом отдельные зоны в толще субстрата избыточно населяются клетками и возникает локальная нехватка питательных ресурсов, значительная же часть субстрата остается незатронутой.

31 Твердофазный биореактор

32 Субстрат с посевным материалом размещают на модульных основаниях и пропускают увлажненный воздух.

33 Жидкофазное поверхностное культивирование Поверхностные жидкофазные процессы в биотехнологических производствах используют для культивирования мицелиальных грибов при получении органических кислот, ферментных препаратов, кормовой биомассы. Для этих целей применяется кюветный способ культивирования. Среда загружается в стерильные кюветы, размещаемые на открытых стеллажах в растильных камерах с регулируемым температурно-влажностным режимом. Вентиляцию помещений осуществляют очищенным стерильным воздухом, который одновременно выполняет функцию теплового агента. Микроорганизмы растут в виде пленки биомассы на поверхности жидкой питательной среды. После завершения процесса культуральная жидкость сливается из кювет через вмонтированные в днища штуцеры и поступает на обработку.

34 Процессы суспензионного или глубинного культивирования Простейшая классификация процессов суспензионного или глубинного культивирования: 1) периодическое культивирование; 2) продленное оптимизированное периодическое культивирование с подпиткой или без нее; 3) многоциклическое культивирование; 4) полунепрерывное культивирование; 5) непрерывно-синхронное культивирование; 6) непрерывное культивирование.

35 Периодическое культивирование Периодический метод культивирования предусматривает внесение посевного материала в питательную среду (инокуляция клетками среды) в начале процесса и получение культуры по достижении заданной фазы развития популяции. Концентрация микроорганизмов в периодической культуре нарастает и останавливается либо из-за лимитирования субстратом, либо из-за ингибирования токсичными продуктами жизнедеятельности. Практически все системы периодического культивирования являются закрытыми, поскольку микроорганизмы в них размножаются и проходят все фазы развития без притока питательной среды и оттока культуральной жидкости.

36 При изучении динамики роста культур микроорганизмов необходимо строго соблюдать некоторые условия: 1)жизнеспособность засева; 2) наличие в среде культивирования всех необходимых питательных веществ; 3)отсутствие в среде ингибиторов, подавляющих рост клеток; 4) поддержание в среде оптимальными всех физико-химических условий.

37 Рис. Основные фазы кривой роста периодической культуры микроорганизмов

38 Параметры кривой роста Под урожаем клеток (Х) понимают разность между максимальной и исходной массой бактерий: X = X maх – Х о. Особенно важно отношение урожая клеток к количеству потребленного субстрата (X/S). Если обе эти величины выражают в весовых единицах, то отношение Х/S, называемое экономическим коэффициентом, обозначают через Y : Y = dХ/dS, где dX – увеличение биомассы, соответствующее потреблению субстрата в количестве dS. Важность экономического коэффициента состоит в том, что он выражает количественные потребности организма в пище.

39 Если же урожай (в граммах) относят к числу молей потребленного субстрата, то экономический коэффициент, называемый в этом случае молярным экономическим коэффициентом, обозначают через У m. Молярный экономический коэффициент позволяет связать урожай клеток с полученным из какого-либо источника энергии (т. е. какого-либо субстрата) количеством АТФ. У АТФ - энергетический коэффициент, выражается в граммах клеточной массы на 1 моль АТФ.

40 Скорость потребления субстрата культурой в данный момент времени выражается соотношением: dS/dT = qX, где X – биомасса, а коэффициент q известен как метаболический коэффициент или удельная скорость метаболизма. Метаболический коэффициент можно выразить также через экономический коэффициент и удельную скорость роста и представить еще в таком виде: q = /Y.

41 Если удовлетворены все необходимые требования, то в течение единицы времени dt увеличение биомассы dX должно быть пропорционально количеству биомассы X и интервалу времени, т. е.: dX = Х.dt, откуда dХ/dt = Х или = dХ/dt. 1/X Дифференциальное отношение dХ/dt выражает скорость роста популяции клеток. Параметр, обозначающий скорость роста единицы биомассы (I/Х) (dХ/dt), называется удельной скоростью роста.

42 Для того, чтобы рассчитать время генерации клеток можно использовать уравнение, учитывая геометрическую прогрессию роста: N = N o. 2 n, откуда lgN = lgN o + n lg2, где N число клеток. Отсюда число клеточных делений (n) составит: n = lgN-lgN o /lg2. Константа скорости деления или число клеточных делений в единицу времени t-to можно вычислить по формуле: ν=n/t, а время одной генерации (g) по формуле: g=t/n=1/ν

43 Многоциклическое культивирование Многоциклическими процессами культивирования называют такие, в которых цикл выращивания культуры повторяется многократно без многократной стерилизации емкости. Зависимость концентрации микроорганизмов и удельной скорости роста от времени в каждом цикле многоциклического процесса имеет характер, аналогичный таковому в периодическом процессе.

44 Продленное периодическое оптимизированное культивирование Продленный периодический процесс культивирования, как и периодический, предусматривает одноразовую загрузку и разгрузку ферментера. Однако цикл развития микроорганизмов в продленном периодическом процессе удлиняется либо за счет подпитки (периодической или непрерывной), либо за счет длительного удержания клеток в системе ( диализ ).

45 Культивирование с подпиткой Если зависимость удельной скорости роста от количества субстрата имеет насыщение, то исходную концентрацию субстрата можно задать сразу побольше в пределах плато, где влияние субстрата на скорость роста биомассы невелико или вообще отсутствует. В этом случае пока концентрация субстрата не снизится до критического уровня подпитку можно не производить. Если зависимость удельной скорости роста биомассы от концентрации субстрата имеет экстремум, то подпитка требуется уже с самого начала процесса для поддержания его на оптимальном уровне.

46 Подпитка может осуществляться импульсно или по каплям на протяжении всего процесса. Практически получается, что скорость подпитки возрастает во времени по экспоненте. И концентрация биомассы возрастает по экспоненте из-за почти постоянной удельной скорости роста при постоянной величине субстрата. Такие культуры часто называют «расширенными» или «экспоненциальными». Варианты способ управления подпиткой: 1. Заранее рассчитывается программа изменения подпитки во времени, и субстрат подается в аппарат без информации о том, с какой скоростью его потребляет культура. Это может привести как к избытку, так и к недостатку субстрата в среде. 2. Субстрат подается по одному из косвенных параметров, связанных с ростом культуры. Культивирование с повторяющимися подпитками.

47 Диализные системы Диализ – исторический первый метод очистки – был предложен Т. Грэхемом в 1861 г. для удаления из системы низкомолекулярных веществ. Суть этого метода заключается в том, что культура развивается в пространстве, ограниченном полупро- ницаемой мембраной, а продукты диффундируют во внешний раствор.

48 Диализные мембраны Для культивирования с диализом используются мембраны, отличающиеся размером пор. Диализные мембраны задерживают клетки и макромолекулы, но проницаемы для таких мелких молекул, как основные питательные компоненты, требующиеся микроорганизмам для их роста. Диализные мембраны изготавливают из пергамента, целлофана, ацетатцеллюлозы, полиамида, поликарбо- ната, кремний и др. Для микробиологических целей при изготовлении мембран используют материалы, обеспечивающие автоклавируемость мембран, размер их пор, высокий уровень отсечки, химическая инертность и проницаемость (которая в свою очередь определяется пористостью, емкостью и толщиной мембраны), а также наибольший экономический коэффициент.

49 Диализные культуры применяются в основном в трех случаях: 1) для концентрирования недиффундирующего продукта, 2) для уменьшения концентрации диффундирующего продукта, ингибирующего рост клеток, и повышения выхода биомассы, 3) для накопления и отделения от клеток диффун- дирующего продукта. Преимущества процесса диализа: 1) работа в мягких условиях температуры и рН; 2) отсутствие органических растворителей; 3) возможность высокой степени очистки клеток от примесей низкомолекулярных соединений, солей и металлов. Недостатки: 1) низкая скорость диализа, определяемая молекулярной диффузией; 2) возможность обрастания диализных мембран и забивания их пор.

50 Для повышения эффективности диффузионного способа культивирования объем диализной жидкости должен быть значительно больше объема диализуемой культуры, или же диализную жидкость следует менять. Кроме того, мембраны должны иметь достаточную площадь, чтобы обеспечивалась удовлетворительная скорость диффузии. Система культивирования с диализом может действовать in vivo или in vitro в периодическом и непрерывном режимах или при их сочетании.

51 К специфическим преимуществам использования диализа при культивировании микроорганизмов относятся: 1) удлинение экспоненциальной фазы роста в периодической культуре, что позволяет получать высокие плотности живых клеток; 2) увеличение стационарной фазы роста культур, что позволяет увеличить выход метаболитов, связанных с этой фазой; 3) удаление или разведение ингибирующих продуктов метаболизма; 4) установление состояния равновесия с высоким уровнем метаболизма; 5) получение метаболитов, свободных от клеток, и, наоборот, клеток, свободных от макромолекул среды.

52 Типы диализаторов Диализатор объемного типа Конструкция диализатора такого типа чрезвычайно проста и представляет собой «мешок» из диализной мембраны, погруженный в диффузат. Достоинствами такой конструкции является крайняя простота и дешевизна. Но аппараты данной конструкции имеют ряд существенных недостатков. Во-первых, в таком аппарате малая удельная поверхность и довольно большая толщина мембран для обеспечения их механической прочности. Во-вторых, процесс диализа протекает крайне медленно, т.к. и диализат, и разделяемый раствор неподвижны и мембраны имеют большую толщину.

53

54 Аппарат этого типа включает мембрану в виде трубки, свернутой в спираль (змеевик), погруженную в емкость с диализатом. За счет конструктивных особенностей увеличивается площадь мембраны, а за счет прокачивания разделяемого раствора внутри змеевика, интенсифицируется массообмен (возрастает коэффициент массоотдачи). Конструкция диализатора змеевикового типа

55 Конструкция диализатора типа "фильтр-пресс Положительной особенностью диализаторов типа фильтр- пресс с плоскокамерными фильтрующими элементами является простота конструктивных решений. Кроме того, в таких аппаратах можно использовать мембраны малой толщины, что снижает сопротивление массопререносу и обеспечивает больший поток через мембрану. Недостатки: использование ручных операций при их сборке и разборке, высокая металлоемкость, относительно низкая плотность укладки мембран в единице объема, сложность герметизации отдельных узлов.

56

57 Конструкция диализатора с полыми волокнами Диализатор представляет собой пластмассовый, стеклянный или металлический корпус, закрытый крышками с уплотнителями, в который помещен пучок параллельно уложенных полых волокон, концевые части которых закреплены в пластмассовом блоке- коллекторе.

58 Электродиализ Некоторых недостатков диализа удается избежать за счет применения электродиализа (Доре, 1910). В этом случае параллельно мембранам и диализуемой жидкости накладывается электрическое поле, в результате чего анионы и катионы из раствора диффундируют через диализные мембраны к аноду и катоду, а клетки остаются в растворе. В простейшем случае электродиализатор состоит из 3 камер, отделенных друг от друга полупроницаемыми мембранами – центральной для обрабатываемого раствора, а также для пермеата в зоне анода и пермеата в зоне катода по обеим сторонам от центральной камеры.

59 Мембраны при катоде и при аноде могут быть выполнены из разного материала, селективного для катионов и анионов. Недостатком электродиализа является выделение при высоком напряжении большого количества тепла, что может привести к необратимым изменениям в системам с биологическими компонентами.

60 Полунепрерывное культивирование В полунепрерывных системах полная загрузка и разгрузка ферментера осуществляются однократно, однако в процессе роста культуры часть ее сливается, а освободившийся объем заливается свежей питательной средой, т.е. функционирует отъемно-доливная или сливно-доливная система. Следовательно, полунепрерывное культивирование характеризуется частотой и объемом сливаемой выросшей культуры и добавлением свежей питательной среды в рабочую емкость ферментера.

61 Установившиеся режимы полунепрерывного культивирования характеризуются колебанием концентрации микроорганизмов около одной и той же постоянной величины и относительным постоянством средней удельной скорости роста популяции. Полунепрерывное культивирование микроорганизмов осуществляется в открытой динамической гомогенной одностадийной системе в любом ферментере для периодического культивирования, оснащенном системой перемешивания и аэрации. Различные варианты полунепрерывных систем используются в производстве дрожжей, водорослей, антибиотиков, лимонной кислоты и других.

62 Преимущества периодических и полунепрерывных процессов Малая стоимость аппарата и системы управления. Гибкость – возможность наработки в одном биореакторе разных продуктов. Время культивирования можно произвольно менять. Процесс меньше подвержен контаминации и мутациям клеток из-за отсутствия протока и относительно малого времени процесса. Процесс удобен для получения малого количества продукта. Условия культивирования можно поддерживать в оптимуме как в фазе роста биомассы, так и в фазе биосинтеза продукта, причем оптимальные условия для биомассы и продукта могут быть различны. Процесс удобен для реализации биосинтеза вторичных метаболитов.

63 Недостатки периодических и полунепрерывных процессов Необходимость частого приготовления посевного материала. Большое непродуктивное время процесса. В связи с необходимостью частой стерилизации быстрее изнашиваются измерительные приборы (датчики рН). Производительность по биомассе и целевому продукту часто ниже, чем в непрерывных процессах. Труднее поддерживать необходимые параметры. Процесс более опасен для человека (аппарат чаще открывают, моют, что сопряжено с контактом с микроорганизмами и продуктами их жизнедеятельности).

64 Непрерывное культивирование В отличие от периодического культивирования в непрерывных процессах питательная среда подается непрерывно, удаление биомассы и продуктов ее жизнедеятельности также осуществляется непрерывно. По такому принципу организуются 2 разновидности процессов непрерывного культивирования: процессы полного (идеального) смешения, или хемостатные процессы, и процессы полного вытеснения, или тубулярные процессы.

65 Установившиеся режимы непрерывного культивирования характеризуются постоян- ством концентрации микроорганизмов и удельной скорости роста популяции. Непрерывное культивирование проводится в открытой динамической системе, которая может быть как гомогенной, так и гетерогенной. Эта система способна к длительной работе в постоянном установившемся режиме.

66 Хемостатные процессы непрерывного культивирования Гомогенные системы идеального смешения Любой периодический процесс можно перевести в непрерывно-проточный. Непрерывно-проточное культивирование открывает возможности для поддержания постоянных условий роста путем создания такого состава питательной среды, чтобы только один желаемый фактор лимитировал рост. Если в таком процессе плотность популяции определяется химическим составом среды (концентрацией лимитирующего рост фактора), его называют хемостатным культивированием.

67 Изменяя концентрацию лимитирующего рост фактора, можно изменять плотность популяции, т.е. изменяя скорость разбавления, можно получать режимы, обеспечивающие различную скорость роста популяции. При таком методе, регулируя скорость протока, можно воспроизвести любую точку роста периодической культуры. В системе идеального смешения микроорганизмы растут в биореакторе при интенсивном перемешивании в культуральной среде, постоянной по своему составу, и, следовательно, в каждый данный момент времени находятся в одном и том же физиологическом состоянии, т.е. в состоянии установившегося динамического равновесия, которое называют «steady state».

68 В установившемся режиме скорость протока среды, отнесенная к единице объема культуры в ферментере, называется коэффициентом разбавления (D) и равняется удельной скорости роста. При этом культура находится в устойчивом стационарном состоянии динамического равновесия и обладает способностью самопроизвольно автоматически подстраиваться к изменениям условий.

69 При таком способе культивирования нельзя получить устойчивого состояния только при максимальной скорости роста. В хемостате практически можно только приблизиться к максимальной удельной скорости роста, но не достичь ее, потому что такая скорость роста соответствует критической скорости разбавления, при которой биомасса вымывается из ферментера, что является одним из существенных недостатков хемостата. Для борьбы с данным явлением возможно использовать комплекс «ферментер-сепаратор». В этом комплексе выходящая из ферментера жидкость сгущается на сепараторе, и часть сгущенного потока непрерывно возвращается в ферментер, остальная часть идет как товарный продукт. Осветленная жидкость сбрасывается в стоки. Основными направлениями использования реципкуляции являются: повышение производительности системы непрерывного культивирования и более полное потребление субстрата из среды.

70 Одностадийный хемостат применяется при необходимости воспроизвести на протоке любую скорость роста клеток, кроме максимальной. Двухстадийный хемостат позволяет создавать культуры при скорости роста, близкой к максимальной, и определять условия ее повышения. Для этого в первом ферментере ведется культивирование при скорости разбавления, меньшей чем удельная скорость роста, а во второй подается культура из первого.

71 Особенности двуххстадийного хемостата: 1. Вымывания культуры во втором ферментере не происходит из-за непрерывного поступления культуры из первого. Следовательно, концентрация биомассы никогда не сможет стать равной нулю при любой скорости разбавления. Будет возрастать удельная скорость роста клеток и экономический коэффициент. 2. Концентрация субстрата во втором аппарате всегда меньше, чем в первом. Субстрат расходуется из запаса входящего потока. Это имеет значение в тех случаях, когда важен не только выход биомассы, но и ее чистота. 3. Концентрация биомассы во втором аппарате всегда выше, чем в первом (учитывается прирост биомассы). 4. Двухстадийный хемостат часто оказывается удобней для тех процессов, в которых целевым продуктом является не биомасса, а метаболиты.

72

73 Рис. Схема функционирования трехстадийного хемостата : S o – концентрация субстрата в подаваемой среде, S 1, S 2, S 3 – концентрация субстрата в ферментерах; Х 1, Х 2, Х 3 – концентрация клеток в ферментерах.

74 Другой широко известный принцип управления процессом – турбидостат. В нем подача питательной среды осуществляется по команде фотоэлектрического элемента, регистрирующего оптическую плотность культуры. Скорость разбавления сама устанавливается в соответствии с заданной плотностью популяции. Этим турбидостат отличается от хемостата, в котором фиксируется скорость разбавления, соответственно которой устанавливается концентрация биомассы.

75 Хотя теоретически взаимосвязь между концентрацией биомассы и скоростью разбавления подчиняется одним и тем же закономерностям в хемостате и турбидостате, методы управления процессами различны. Турбидостат позволяет получать максимальные скорости роста, которые применяются при культивировании клеточных культур, фиксированных в стадии экспоненциального роста. Хемостаты же применяют при скоростях разбавления от самой низкой до только приближающейся к максимальной удельной скорости роста.

76 Рис. Схема работы турбидостата : S o – концентрация субстрата в подаваемой среде, S 1 – концентрация субстрата в вытекающей культуре, Х – концентрация клеток.

77 В настоящее время разработаны различные варианты непрерывного культивирования микроорганизмов, работающие по принципу турбидостата – pH-стат, оксистат, СО 2 -стат, теплостат, респиростат, вискозистат и т. д., названия которых соответствуют задаваемому параметру. Любой параметр, который изменяется в периодической культуре и на который существует датчик, может быть использован для управления ростом по типу турбидостата. Управляющими параметрами могут быть комплексные параметры, например, содержание кислорода и углекислоты в отходящем воздухе, характеризующие дыхательный коэффициент.

78 Респиростат Способ управления основан на использовании в качестве датчиков газоанализаторов кислорода или углекислого газа, измеряющих интенствность дыхания культуры. Эта величина пропорциональна росту, образованию продукта и поддержанию жизнедеятельности клеток, т.е. пропорциональна концентрации биомассы. Поэтому, регулируя интенсивность дыхания можно регулировать и концентрацию биомассы, а следовательно, скорость подачи субстрата (D). В респиростате задается определенная величина интенсивности дыхания, близкая к максимальной. В зависимости от этого при снижении интенсивности дыхания величину скорости разбавления повышают, и наоборот. Еще лучше не поддерживать дыхание на постоянном уровне, а все время искать скорость разбавления, обеспечивающую его максимум. Этот алгоритм управления легко реализуется с помощью современных систем управления процессами культивирования.

79 Оксистат В этом способе управления подачу питательной среды в аппарат (скорость разбавления) осуществляют таким образом, чтобы поддерживать в среде постоянное, относительно малое значение концентрации растворенного кислорода, поскольку при минимальной концентрации растворенного кислорода достигается максимальная величина его потребления клетками микроорганизмов. Поддержанием потребления кислорода на минимально возможном уровне обеспечивается максимизация производительности процесса. При этом не следует забывать, что, как всякий субстрат, растворенный кислород влияет на скорость роста биомассы и через нее на скорость потребления кислорода (интенсивность дыхания). Форма этой зависимости такова, что при возрастании концентрации кислорода скорость роста биомассы сначала увеличивается очень быстро, но выше некоторой величины, обозначаемой как «критическая» концентрация растворенного кислорода, скорость роста и скорость потребления кислорода уже практически не зависят от его концентрации. Поэтому в таком способе управления процессом культивирования концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне, близком к «критической» концентрации, за счет изменения скорости подачи свежей среды в аппарат (а не изменяя режимные параметры аэрации и перемешивания).

80 рН-стат. Активный рост микроорганизмов часто сопровождается закислением культуральной среды, в то время как замедление роста при недостатке субстрата вызывает защелачивание. Следовательно, величина рН может использоваться как параметр, в зависимости от которого в аппарат подается питательная среда. Скорость подачи регулируется таким образом, чтобы величина рН поддерживалась на некотором постоянном уровне. При этом исключают регулирование рН подачей в аппарат щелочи или кислоты. Нутристат. В этом способе управления подача питательной среды в аппарат осуществляется так, чтобы поддерживать заданное значение концентрации субстрата на постоянном уровне для обеспечения максимальной скорости роста. Этот способ имеет неудобство: необходимо непрерывно измерять концентрацию субстрата в аппарате, что не всегда просто.

81 Теплостат В обычных условиях культивирования температуру поддерживают на уровне оптимальной. Как правило, это обеспечивается путем регулирования подачи охлажденной воды в рубашку или змеевик аппарата. Когда при увеличении теплового потока повышается температура, регулятор увеличивает скорость подачи охлаждающей воды. При этом также увеличивается и скорость теплоотвода, что позволяет сохранять равновесие. В теплостате температура устанавливается самопроизвольно на уровне, при котором скорость биологического тепловыделения равна скорости отвода тепла в окружающую среду. Данный уровень обычно выше оптимального, что может замедлять процесс ферментации, хотя и обеспечивает его постоянную скорость. Способ управления широкого применения не имеет. Может быть использован, если по определенным причинам некий ценный целевой продукт выделяется при повышенных температурах.

82 В промышленности одностадийные хемостатные процессы ферментации применяется для получения микробной массы или тех продуктов, кинетика накопления которых повторяет кинетику роста биомассы. Применение многостадийных систем позволяет получать культуру при любой скорости роста – от лаг-фазы до экспоненциальной и стационарной. Многостадийные системы обычно используются для получения вторичных продуктов микробного синтеза, кинетика накопления которых в той или иной степени отстает от кинетики роста биомассы. Многостадийное культивирование с успехом применяется при получении органических кислот, этилового спирта и т. д. Батарея ферментеров применяется также для переработки высоких концентраций субстрата при получении продуктов как первой, так и второй фазы роста.

83 Тубулярные процессы непрерывного культивирования Системы культивирования полного вытеснения Этот способ культивирования используется для анаэробных условий. Открытая система полного вытеснения отличается от системы идеального смешения тем, что культура в ней не перемешивается и представляет собой поток жидкости через трубку. Наиболее распространенным аппаратом является трубчатый реактор, который может иметь различную форму (прямую, S- образную, спиральную) и устанавливается горизонтально или вертикально. Питательная среда и посевной материал смешиваются на входе и непрерывно поступают в аппарат без обратного смешения. В аппарате башенного типа жидкость движется снизу вверх.

84 В момент подачи среды и посевного материала на входе в трубчатый реактор, популяция клеток находится в начале цикла развития. По ходу трубки культура стареет, субстрат исчерпывается, накапливаются продукты метаболизма, и вытекающая культура находится в состоянии, аналогичном стационарной фазе роста периодической культуры. Следовательно, система полного вытеснения представляет собой пространственный, проточный вариант периодической культуры. Такая культура за время от посева до выгрузки проходит через все стадии периодической культуры, т. е. фазы роста распределены не во времени, а в пространстве, причем каждой части ферментера в установившемся режиме соответствует определенный отрезок ростовой кривой.

85 Рис. Трубчатый ферментер полного вытеснения: S o – концентрация субстрата в поступающей среде, S – концентрация субстрата в вытекающей среде, Х о – начальная концентрация биомассы, Хо – концентрация вытекающей биомассы.

86 Преимуществом тубулярного процесса является возможность более полного исчерпания субстрата (как и в периодическом процессе), недостатком – большая склонность к контаминации и невозможность организовать аэрацию по всей длине аппарата.

87 Синхронно делящиеся культуры микроорганизмов Культуры микроорганизмов, даже отобранные в одно и то же время, представляют собой совокупность клеток, находящихся на разных стадиях своего индивидуального развития. Стремление получить культуры, все клетки которых в данный момент времени находятся в одной фазе развития, привело исследователей к разработке метода синхронизации деления микроорганизмов. Сущность метода синхронизации заключается в том, что путем различных воздействий микробная популяция искусственно приводится в однородное физиологическое состояние. Наиболее легко определяемым показателем такого состояния популяции является одновременное (синхронное) деление почти всех клеток культуры.

88 Синхронизации деления подвергались различные объекты: грибы, бактерии, гетеротрофные протисты, водоросли, а также клетки культуры ткани и т. п. Среди бактерий синхронное размножение изучалось, главным образом, на популяциях Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Corynebacterium diphtheriae и других.

89 Периодическое синхронное культивирование Для синхронизации деления обычно применяют популяции в фазе экспоненциального роста, когда клетки наиболее однородны по продолжительности периода генерации.

90 Степень участия клеток популяции в синхронном делении называется степенью синхронизации. Она выражается значениями индекса синхронизации, который характеризует степень однородности популяции и позволяет сравнить эффективность различных синхронизирующих воздействий. Для определения степени синхронизации наибольшее распространение получил «индекс синхронизации» Шербаума (Is), вычисляемый по формуле: Is = (N1/N0 – 1). (1 – T/g), где N 0 – число клеток непосредственно перед взрывом синхронного деления; N 1 – число клеток после синхронного деления; Т – время, в течение которого происходит синхронное деление; g – продолжительность одной генерации.

91 Способы синхронизации В зависимости от характера воздействия все известные способы можно разделить на 3 большие группы: 1-я – механический отбор (селективные, или естественные, методы); 2-я – действие физических факторов; 3-я – химико-биологические воздействия.

92 1-я группа методов синхронизации заключается в механическом отборе клеток из популяции в зависимости от их объема, массы или определенной формы существования (споры). Применение селективных методов основано на предположении, что такие свойства, как объем и масса клеток, отражают в известной мере определенное физиологическое состояние. Эти методы имеют то преимущество, что не создают никакого препятствия в обмене веществ у отдельных клеток, как это бывает при использовании других методов.

93 2-я группа связана с физическими воздействиями, также ведущими популяцию к синхронному размножению. В этом направлении наибольшее распространение получили температурные воздействия. Синхронизация популяций с помощью изменения температуры культивирования достигается однократным (шок) или многократным (сдвиги температуры между двухмя уровнями) действием более высокой или более низкой температуры по сравнению с оптимальной для данного вида микроорганизмов. Такое температурное воздействие, блокируя процесс деления, не останавливает роста и развития клеток, что в конечном итоге приводит популяцию в однородное состояние. После снятия шока от 70 до 90 % клеток делится синхронно. Этот вид воздействия в основном применяется для синхронизации бактерий, протистов и клеток культуры ткани.

94 К методам физического воздействия, применяемых для синхронизации деления, также относятся обработка клеток сублетальными дозами рентгеновских лучей и периодическая смена света и темноты, используемая для получения синхронного деления одноклеточных водорослей и цианобактерий (метод считается наиболее естественным, так как основан на цикличности развития фототрофных микроорганизмов в связи с суточной фотопериодичностью).

95 3-я группа факторов, вызывающих синхронное размножение, основана на изменениях состава питательной среды путем введения ингибиторов или извлечения веществ, необходимых для деления. Одним из наиболее распространенных методов синхронизации этой группы является так называемый метаболический шок. При этом эффект синхронизации достигают, применяя «голодные» среды, из которых полностью удалены важнейшие компоненты или значительно снижено их содержание. Последующее добавление недостающего вещества или перенесение клеток в полноценную среду вызывает синхронное деление.

96 Несмотря на разнообразие методов, не всегда удается в достаточной степени синхронизировать деление клеток, в таких случаях принято сочетать различные методы. Общим и весьма существенным недостатком периодических синхронных культур является быстрая потеря синхронности, наступающая через 2 – 3 генерации. Причина подобного явления может заключаться в том, что не все клетки популяции делятся, достигнув одного и того же размера, возраста или времени, прошедшего после предыдущего деления. Десинхронизация наступает быстрее при воздействии на культуру синхронизирующим агентом в фазе замедления скорости размножения, т. е. более гетерогенную в отношении продолжительности генерации отдельных клеток.

97 Непрерывно-синхронное культивирование С середины 60-х годов прошлого века началась разработка методов получения синхронизированных культур на протоке. Такой способ известен как непрерывно- синхронный, или фазовый, метод культивирования, гарантирующий поддержание синхронного деления клеток неограниченно долгое время.

98 Метод основан на периодическом сливе из ферментера половины объема выросшей культуры через промежутки времени, равные одной генерации, и одновременном добавлении равного количества свежей питательной среды, что обеспечивает импульсную подачу источников питания. Состав среды подбирается таким образом, чтобы при удвоении биомассы происходило исчерпание питательных веществ, вследствие чего рост культуры должен быть приостановлен. Добавление свежей среды приводит к восстановлению роста, т. е. синхронизация деления достигается голоданием клеток по какому-либо лимитирующему рост субстрату. Лимитирующими факторами могут служить источники азота, углерода, минеральных солей и т. д.

99 Синхронное деление клеток также может быть индуцировано изменением рН, температуры и других условий культивирования, оказывающих воздействие на ряд метаболических процессов клеток.

100 Протопласты микроорганизмов Слияние протопластов позволяет объединять генетические материалы таких микроорганизмов, которые в естественных условиях не скрещиваются, и создавать рекомбинантные формы, характеризующиеся полезными признаками, ранее им не свойственными. Отсутствие оболочки исключает один из важных барьеров нескрещиваемости микроорганизмов и создает возможность объединения геномов и цитоплазмы для получения гибридного потомства даже у отдаленных форм микроорганизмов.

101 Методы получения протопластов микроорганизмов Выбор метода получения протопластов (протопластирования) определяется видовыми особенностями организмов и, в первую очередь, строением их клеточных стенок, потому что даже внутри прокариот есть существенные различия в строении клеточных стенок, не говоря уже о различиях в структуре прокариотических и эукариотических организмов. Тем не менее, методы получения протопластов у трех различных групп микроорганизмов – бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов – могут быть объединены в две основные группы: 1. ферментативный лизис ригидного слоя клеточной стенки; 2. использование факторов, подавляющих нормальный синтез основных полимеров стенки.

102 Получение протопластов у бактерий Ферментативный лизис ригидного слоя клеточной стенки В 1800 г. А. Фишер впервые показал явление «плазмоптиза» – выхода содержимого клеток в окружающую среду при их помещении в гипертонический раствор – для бактерий Bacillus subtilis и Vibrio proteus. При этом протоплазма обособлялась в виде шарообразных тел (шаров), очень быстро исчезающих.

103 Основная работа по получению протопластоподобных тел у бактерий началась в начале 50-х годов прошлого века. В эти годы с использованием гипертонических растворов различных солей было обнаружено: 1) влияние условий культивирования клеток на выход шарообразных форм; 2) значение концентрации клеток (чем гуще суспензия, тем интенсивнее образование шаров) и 3) влияние рН среды (слабокислая и нейтральная реакция способствовали образованию шаров, в то время как при кислой и щелочной реакции шары не образовывались). Однако целостность полученных шарообразных форм сохранять не удавалось, они быстро лизировались.

104 Следующим шагом в получении протопластоподобных структур явилось ферментативное растворение бактериальной клеточной стенки при помощи гидролитического фермента лизоцима. Толчком к этому послужил установленный Салтоном факт растворения под действием лизоцима клеточных стенок грамположительных бактерий. Однако и в этих экспериментах протопластоподобные тела оказывались очень неустойчивыми.

105 Этого удалось избежать Вейбулу, который обрабатывал бактериальные клетки лизоцимом в гипертоническом растворе сахарозы. Полученные им сферические тела долгое время сохраняли свою целостность при условии помещения их в среду со стабилизатором осмотического давления. Ученый назвал полученные сферические образования протопластами, употребив термин, применявшийся ранее в цитологии растений.

106 На активность лизоцима могут оказывать влияние вещества, используемые в качестве стабилизаторов осмотического давления. Например, использование 0,5 % NaCl тормозит действие лизоцима на клетки. Лучшими стабилизаторами для получения бактериальных протопластов считаются углеводы. Чаще всего применяют 0,1 – 0,6 М растворы сахарозы, глюкозы, раффинозы, мелибиозы, трегалозы. Иногда используют и более высокие концентрации сахаров. Природа и концентрация осмотического стабилизатора могут влиять также на эффективность образования протопластов и на их стабильность.

107 Оптимальной для образования протопластов бактерий является середина логарифмической фазы роста, а для многих актиномицетов конец логарифмической фазы роста. Для получения протопластов грамположительных бактерий достаточна простая обработка клеток лизоцимом в гипертоническом растворе. Под действием этого фермента растворяется ригидный пептидогликановый слой клеточной стенки. При этом чувствительность к лизоциму не одинакова не только у разных видов бактерий, но и среди разных штаммов.

108 Для получения протопластов грамотрицательных бактерий простая обработка лизоцимом малоэффективна. В клеточных стенках этих бактерий тонкий слой пептидогликана окружен внешним слоем, состоящим из лигопротеинов, фосфолипидов, липополисахаридов, что делает его недоступным действию лизоцима. Для проникновения фермента к субстрату необходимо нарушение поверхностных слоев клеточной стенки. Подготовка клеток грамотрицательных бактерий для воздействия лизоцимом проводится с помощью различных методов, повышающих чувствительность клеток: путем предварительной инкубации бактерий в жидкой питательной среде при щелочном рН или в присутствии высоких концентраций сахарозы; обработка клеток хелатирующими соединениями (например, Na-ЭДТА) или одно- и дивалентными катионами; применение предварительного замораживания-оттаивания, обрабатка клеток протеолитическими ферментами и липазами.

109 Наиболее удачным оказался метод, предложенный Репаске и до сих пор применяемый для получения протопластов у разных видов грамотрицательных бактерий. Автор показал возможность получения протопластов при совместном действии лизоцима и ЭДТА в среде с рН 7,6-8,0. В 1976 г. Вейсс предложил ускоренный метод получения протопластов кишечной палочки с использованием ЭДТА, модифицировав метод Репаске. Он применил последовательное, а не совместное действие на клетки лизоцима и ЭДТА.

110 Вместо лизоцима в качестве факторов, лизирующих клеточные стенки бактерий, можно использовать также литические ферменты микробного происхождения. Иногда используют более специфические ферментные препараты: лизостафин – для получения протопластов у стафилококков, мутанолизин – для получения протопластов у молочнокислых бактерий.

111 Использование факторов, подавляющих нормальный синтез основных полимеров клеточной стенки Метаболические нарушения при синтезе клеточных стенок происходит в двухх случаях: 1) в результате мутации может возникнуть генетический блок в цепи реакций, ведущих к синтезу полимеров клеточной стенки; 2) при нарушении синтеза клеточной стенки под действием агентов, предотвращающих образование ригидного мукополимера.

112 Методы предусматривают не разрушение готовых клеточных стенок, а ингибирование их синтеза (методы «несбалансированного роста»). Они основаны на подавлении синтеза клеточной стенки структурными аналогами ее компонентов и антибиотиками. С этой целью используют пенициллин и фосфомицин или высокие концентрации аминокислот глицина, метионина, треонина и др., нарушающие синтез пептидогликана муреина – основного компонента ригидной оболочки бактерий. Целостность клеточных стенок у некоторых бактерий зависит от наличия в ростовой среде мукополимерных аминокислот – ДАП, цистеина, аланина, лизина, орнитина, глутаминовой кислоты и др. Когда они исчерпываются в процессе роста клеток, синтез клеточных стенок приостанавливается (Streptococcus faecalis).

113 Одним из широко распространенных методов получения протопластов у грамотрицательных бактерий является так называемый пенициллиновый метод, основанный на свойстве пенициллина нарушать синтез муреина. (Впервые предложен Ледермейстером и Келленбергером в 1956 г.). Пенициллиновый метод не эффективен в тех случаях, когда в клетках подавлен синтез активных цитоплазматических компонентов, например при воздействии на клетки хлорамфениколом, стрептомицином или хлортетрациклином.

114 Для получения протопластов у грамположительных бактерий пенициллиновый метод непригоден. Объясняется это тем, что мукополимерный слой в клеточной стенке этих бактерий не защищен дополнительными слоями, как у грамотрицательных бактерий, и при культивировании с антибиотиком клетки претерпевают лизис. Однако метод может успешно применяться для получения протопластов бактерий, для которых другие методы были неэффективны (Corynebacterium glutamicum). В настоящее время эти методы в основном утратили самостоятельное значение.

115 Помимо указанных способов, протопласты у бактерий могут быть получены и другими методами: под влиянием глицина, фагового литического фермента, нормальной и иммунной сывороток, комплимента, методом автолиза и т. д. Протопласты, полученные из грамотрицательных и грамположительных бактерий, по качеству оставшихся поверхностных структур различаются между собой. У протопластов грамположительных бактерий клеточная стенка отсутствует полностью, и их сферические тела окружены лишь цитоплазматической мембраной. Сферические тела грамотрицательных бактерий сохраняют значительную часть сложноорганизованной клеточной стенки и называются сферопластами.

116 В процессе культивирования протопласты и сферопласты способны увеличиваться в размерах, иногда даже на треть своей величины, и делиться. Деление протопластов может быть как равновеликое, так и неравновеликое, в виде почкования. Дочерние протопласты обычно меньшего размера. Протопласты, полученные из микробных клеток, сохраняют большинство их свойств. Они жизнеспособны в изотонической питательной среде при близких величинах осмотического давления среды и содержимого протопласта, способны метаболизировать и продуцировать различные вещества, расти и делиться.

117 Получение протопластов у грибов Гиаджа первым показал, что пищеварительный сок виноградной улитки способен растворять клеточные стенки дрожжей. Анализ химического состава выявил наличие целого комплекса ферментов: глюканазы, маннаназы, протеазы, липазы, хитиназы, целлюлазы, гемицеллюлазы, пектиназы и др. Первые дрожжевые протопласты под действием улиточного сока Helix pomatia («геликаза») были получены Эдди и Вильямсоном в 1957 году.

118 При воздействии на клеточную стенку грибов литическими ферментами образуется пора, через которую затем протоплазма выходит в окружающую среду, и в присутствии стабилизатора осмотического давления благодаря поверхностному натяжению мембраны приобретает сферическую форму – образуется протопласт. У дрожжевых клеток пора обычно образуется на одном из полюсов или в экваториальной зоне. Принято считать, что основную роль при лизисе грибных клеточных стенок играют глюканазы, так как именно глюканы являются одними из главных компонентов клеточных стенок дрожжей. Однако для быстрого и эффективного лизиса сложноорганизованной стенки грибов необходимо также присутствие в литическом комплексе и других гидролаз. При совместном воздействии нескольких ферментов проявляется синергический эффект.

119 Для получения грибных протопластов широко и успешно применяется литический комплекс Streptomyces spp. и некоторые другие. Для ферментативного лизиса клеточных стенок применяют или культуральную жидкость после инкубирования микроорганизма, или очищенный ферментный препарат. Перед употреблением в смесь ферментов вносят стабилизатор осмотического давления и стерилизуют фильтрацией через мембранный фильтр. Процесс растворения клеточных стенок под действием литического комплекса может продолжаться от нескольких часов до 2 суток.

120 На образование протопластов, особенно у грибов, значительно влияет возраст культуры. Поэтому рекомендуется использовать молодые дрожжевые клетки и мицелий. Причем, различная возрастная чувствительность грибных клеток к действию литических ферментов объясняется скорее количественными изменениями в клеточной стенке, чем качественными,

121 Для облегчения процесса получения грибных протопластов можно использовать воздействие редуцирующих веществ (меркаптоэтанола, дитиотреитола, цистеина-HCl, сульфида натрия). Хотя механизм их действия на клетки полностью не выяснен, предполагается, что эти соединения разрывают дисульфидные связи в поверхностном маннан- протеиновом слое, облегчая этим доступность глюкановой матрицы действию литических ферментов. Лизис грибных клеточных стенок может быть облегчен также обработкой клеток хелатирующими соединениями (Na-ЭДТА) или применением таких приемов, как замораживание-оттаивание.

122 Лучшими стабилизаторами осмотического давления для грибных протопластов оказались 1 М раствор хлористого натрия и смесь 1 М раствора хлористого натрия с 1 М раствором маннита в соотношении 1:1.

123 Получение стабильных и жизнеспособных протопластов у двухх штаммов Acremonium chrysogenum, отличающихся уровнем антибиотикообразования

124 Регенерация клеточной стенки и реверсия к клеточным формам Реверсии протопластов бактерий и грибов характеризуется определенным сходством. При этом условно можно выделить на три этапа: 1) регенерация клеточной стенки, 2) реверсия, появление клеток-ревертантов, 3) восстановление нормального цитокинеза и появление клеток исходной формы. Вместе с тем каждой группе микроорганизмов присущи свои особенности протекания реверсии протопластов, связанные со строением клеток и клеточных стенок, характером метаболизма и цитокинеза.

125 Очень важным фактором, влияющим на реверсию протопластов, является плотность окружающей среды. Жидкие среды для регенерации практически не применяются, поскольку для эффективной регенерации клеточной стенки, очевидно, необходим контакт цитоплазматической мембраны с каким-либо поддерживающим каркасом.

126 Реверсия протопластов спорообразующих бактерий происходит гораздо лучше на средах, содержащих 2% агара, чем на средах с 0,7 – 0,8% агара. Значительно повышает частоту регенерации применение двуххслойного метода. Протопласты ресуспендируют в мягком (0,4 – 0,7%) агаре или легкоплавкой агарозе и помещают на твердую агаризованную среду (1,5 – 2% агара). Эффективность и скорость реверсии протопластов существенно повышается, если их высевать не на свежеприготовленные, а на частично (на 10 – 20%) дегидратированные чашки. Твердой или полутвердой основой также может быть желатина (5-30%), мембранные фильтры, убитые бактериальные клетки или клеточные стенки.

127 Кроме того, эффективность реверсии зависит от присутствия аминокислот, витаминов и микроэлементов. Вместе с тем, на очень богатых средах уровень реверсии снижается, вероятно, в связи с несбалансированностью процессов роста протопластов и синтеза компонентов клеточной стенки. Протопласты очень чувствительны к повышенной температуре, и поэтому даже кратковременное ее воздействие резко снижает эффективность реверсии. Варьируя соответствующие параметры, можно подобрать условия для реверсии протопластов самых разных видов микроорганизмов. Однако только определив условия, обеспечивающие удовлетворительную реверсию протопластов (обычно, не ниже 0,1%) к клеточной форме, можно приступать к их слиянию.

128 Слияние протопластов стало возможным после того, как было обнаружено, что эффективным индуктором процесса является ПЭГ (Као, Mихайлюк, 1974). Поверхность клеток и протопластов заряжена отрицательно и окружена водным слоем. Эти факторы препятствуют контакту и слиянию мембран. Действие ПЭГ сводится к тому, что он, по-видимому, снижает поверхностный заряд протопластов и дегидратирует клетки. Тем самым создаются условия для тесного контакта и слипания мембран. В местах слипания происходит разрыв мембран и содержимое двухх соседних протопластов объединяется. Образующиеся структуры сохраняют способность к восстановлению клеточной стенки. В результате появляются гибридные клетки.

129 ПЭГ чаще всего применяют в концентрации 30 – 50% (масса/объем). При этих концентрациях осмотические стабилизаторы можно не использовать, поскольку эту функцию выполняет сам ПЭГ. Ионы кальция повышают частоту слияния протопластов, и при pH 7,5 оптимальная их концентрация составляет 10 мМ. Ионы марганца обычно ингибируют слияние. Слияние протопластов идет уже при 4°С, и эффективность его увеличивается при повышении температуры до 30°С. В этих условиях для успешного завершения процесса достаточно 2 – 5 мин инкубации с ПЭГ.

130 Для слияния протопластов берут генетически маркированные штаммы микроорганизмов, часто несущие мутации ауксотрофности и устойчивости к антибиотикам. Перед обработкой ПЭГ суспензии протопластов исходных (родительских) штаммов смешивают и осаждают центрифугированием, что повышает частоту слияния. Затем смесь ресуспендируют и высевают на гипертонические среды. Продукты слияния протопластов называются фузантами (от англ. fusion слияние).

131 При прямой селекции фузанты отбирают сразу на селективных гипертонических средах, где не могут ревертировать протопласты родительских штаммов. При непрямой селекции смесь протопластов, обработанную ПЭГ, высевают на неселективную гипертоническую среду, а для отбора фузантов выросшие колонии переносятся на селективные среды, не содержащие осмотического стабилизатора. Специфика отбора рекомбинантов, возникающих при слиянии протопластов, состоит в том, что необходимо создать подходящие условия не только для их селекции, но и для реверсии их к клеточной форме. Часто эти два процесса не могут эффективно осуществляться на минимальных средах. Поэтому чаще используется непрямой метод селекции фузантов.

132 В слиянии может участвовать более двухх протопластов разных штаммов, и в результате сразу появляются рекомбинанты, наследующие признаки трех (и более) родителей. Образующиеся диплоидные, полиплоидные формы и гетерокарионы (у грибов) обычно не стабильны и в неселективных условиях выщепляют гаплоидные рекомбинанты и исходные родительские формы. Потомство первичных колоний, образовавшихся на селективной среде после слияния протопластов, может состоять из следующих классов: 1) колоний, дающих смешанную популяцию нестабильных форм; 2) колоний, дающих смешанную популяцию стабильных форм; 3) колоний, дающих однородное и стабильное потомство.

133 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ АНАЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ Выращивание анаэробных микроорганизмов более сложно, чем культивирование аэробов, так как контакт их клеток с кислородом воздуха должен быть сведен к минимуму или даже полностью исключен. Для этого используют разные приемы, нередко комбинируя их друг с другом.

134 1. Выращивание в высоком слое среды Это наиболее простой способ ограничения доступа воздуха к клеткам микроорганизмов. Жидкую среду наливают в сосуды для культивирования высоким слоем. Так как нельзя стерилизовать среды, если они занимают более половины высоты сосуда, часть среды стерилизуют отдельно и стерильно доливают ее сосуд для культивирования сразу же после посева. Непосредственно перед посевом среду кипятят или прогревают на кипящей водяной бане мин, затем быстро охлаждают, чтобы в ней не успел раствориться кислород воздуха, и вносят на дно посевной материал.

135 2. Культивирование в вязких средах Диффузия кислорода в жидкость уменьшается с увеличением ее вязкости. Поэтому в вязких средах, таких как картофельная или среды с кукурузной либо другой мукой, хорошо развиваются некоторые облигатные анаэробы, например, возбудители маслянокислого или ацетонобутилового брожения. Вязкость жидких сред легко увеличить, если добавить к ним 0,2-0,3 % агара.

136 3. Выращивание в толще плотной среды Этим приемом пользуются для получения изолированных колоний при выделении чистых культур или определении численности анаэробных микроорганизмов. Посевной материал вносят в расплавленную и остуженную до С агаризованную, желательно осветленную среду, тщательно перемешивают и оставляют в пробирках или переносят стерильной пипеткой в заранее простерилизованные обычные пробирки, трубки Бури или чашки Петри.

137 Поверхность среды в пробирках заливают парафином. Трубки Бури – это стеклянные трубки длиной см, диаметром 1,0-1,5 см (трубки стерилизуют, закрыв оба конца ватными пробками). Перед посевом ватную пробку у одного конца заменяют стерильной резиновой, через другой конец трубки вносят среду с посевным материалом и закрывают также резиновой пробкой. При использовании чашки Петри для выращивания анаэробов засеянную агаризованную среду наливают в крышку чашки и, после того как среда застынет, плотно прижимают к ее поверхности дно чашки. Зазор между стенками дна и крышки, где среда соприкасается с воздухом, заливают стерильным парафином.

138 4. Выращивание в анаэростатах Анаэробные микроорганизмы можно выращивать в анаэростатах – вакуумных металлических камерах, снабженных манометром. Анаэростатом может служить обычный вакуумный стеклянный эксикатор. Из анаэростата откачивают воздух, а затем, как правило, заполняют его газовой смесью, состоящей из азота (90- 80%) и углекислоты (10-20%), до достижения избыточного давления, которое исключает возможность диффузии кислорода воздуха.

139 Анаэростат АЭ-01 предназначен для культивирования в чашках Петри микроорганизмов группы облигатных анаэробов (бактероидов) и микроаэрофилов

140 Для культивирования строгих анаэробов предложены специальные камеры, заполненные газовыми смесями (чаще всего 90% N 2, 5% СО 2 и 5% Н 2 ), которые содержат внутри все необходимое для выполнения микробиологических работ, включая термостат. Это оборудование сложно и дорого, но оно имеет неоспоримое преимущество – контакт клеток с кислородом воздуха остается минимальным на всех этапах работы.

141 Для культивирования анаэробов предложены специальные камеры и газогенерирующая система типа "GasPak", образующая водород и СО 2 в замкнутом пространстве и эффективно поглощающая кислород. Использование специальных газогенерирующих пакетов GasPak, GasPak+, CampyPak или CampyPak+ не требует дополнительного оборудования. Система применяется для культивирования факультативных и облигатных микроорганизмов. Двумя основными составляющими GasPak анаэробной системы являются одноразовый конверт, генерирующий водород и двухокись углерода, таблетки боргидрида натрия и лимонной кислоты и палладиевый катализатор (покрытые палладиумом алюминиевые частицы).

142 GasPak конверты активируются добавлением воды, которая перемещается по серии каналов к прокладке из фильтровальной бумаги, регулирующей скорость поступления воды в отсек к газогенерирующим таблеткам. Таким образом, обеспечивается постепенное высвобождение газа. Водород, генерируемый таблеткой боргидрида натрия при добавлении воды, в присутствии палладиевого катализатора соединяется с порцией кислорода в колбе с последующим образованием воды. Для культивирования анаэробов используют конверты GasPak и генерирующие водород и двухокись углерода.

143 Анаэростат для анаэробного культивирования 12 чашек Петри

144 Одновременная загрузка 36 чашек Петри

145 В качестве поглотителя кислорода в лабораторной практике используют щелочные растворы пирогаллола, дитионита (гидросульфита) натрия, металлическое железо и некоторые другие реактивы. Полноту поглощения кислорода контролируют раствором, содержащим окислительно-восстановительный индикатор. В качестве восстановителя чаще всего используют сульфид и тиогликолат натрия.

146 Некоторые строгие анаэробы, например, метанобразующие бактерии, ацетогены, некоторые грибы, расщепляющие целлюлозу, микроорганизмы рубца жвачных животных, погибают даже при кратковременном контакте с кислородом воздуха. Работа с такими микроорганизмами представляет большие трудности и требует специального оборудования. Для культивирования строгих (облигатных, экстремальных) анаэробов необходимо применять методы, позволяющие исключать молекулярный кислород из сред культивирования, создать и поддерживать в них низкий окислительно- восстановительный потенциал. С этой целью использую технику, разработанную профессором Хангейтом:

147 o среды для выращивания микроорганизмов и все добавки в них готовят перед автоклавированием с максимальной защищенностью от контакта с кислородом (кипячением и т.д.); o после автоклавирования среды и добавки для них немедленно охлаждают в токе стерильного газа (водород, гелий, азот, аргон), освобожденного от следов кислорода пропусканием над медными стружками, нагретыми до С; o до посева микроорганизмов в среды добавляют восстановители (цистеин, сульфид натрия, тиогликолат в щелочной среде) для химического поглощения следов кислорода, диффундирующего в сосуды для культивирования даже через резиновые пробки;

148 o посевы, разлив сред, в том числе агаризованных, проводят в токе стерильного газа, не содержащего кислорода; o микроорганизмы выращивают и поддерживают в герметически закрытых сосудах, в атмосфере бескислородного газа, часто под давлением для исключения проникновения воздуха; o все шланги, по которым идут газы для продувки сосудов, должны быть из специальной резины, со слабой степенью диффузии кислорода воздуха, или заменены на металлические трубки; o все пересевы и добавки в среды проводят с помощью шприцев, продутых газом, не содержащих кислорода.

149 ХРАНЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ К числу наиболее распространенных способов хранения микроорганизмов относятся периодические посевы на свежие питательные среды, сохранение культур на питательных средах под слоем вазелинового масла, хранение клеток в лиофилизированном состоянии. Реже микроорганизмы сохраняют при низких или сверхнизких температурах, в дистиллированной воде или 1%-ном растворе хлористого натрия, на адсорбентах в высушенном состоянии. Выбор метода хранения во многом зависит от целей, для которых используются микроорганизмы, а также от имеющегося в распоряжении исследователя оборудования.

150 Периодические посевы на питательные среды Этот способ был одним из первых приемов длительного сохранения микроорганизмов в лабораторных условиях и до настоящего времени широко используется в практике микробиологических работ. Аэробные микроорганизмы пересевают чаще всего на поверхности скошенной агаризованной среды, микроаэрофилы – в полужидкую среду, содержащую 0,2- 0,3% агара, анаэробы – в толщу плотной среды или в жидкую среду. Культуры пересевают на свежие среды в 2 пробирки (колбы). В дальнейшем из одной пробирки микроорганизмы используют для работы, культуру во второй пробирке оставляют для сохранения и последующего пересева.

151 Частота пересева на свежую среду различных микроорганизмов в большей степени определяется их свойствами. Многие микроорганизмы можно пересевать раз в 1-2 месяца, хотя есть микроорганизмы, например молочнокислые бактерии, которые нуждаются в более частых пересевах. Хранение культур в холодильнике при 4-6 °C позволяет увеличить время между пересевами. Поддержание культур микроорганизмов регулярными пересевами имеет ряд существенных недостатков. Основным из них – возможная утрата некоторых морфологических и физиологических признаков. Кроме того, частые пересевы снижают биохимическую активность культур, повышают опасность инфицирования ее посторонними микроорганизмами. При частых пересевах, особенно на жидких средах, велика вероятность возникновения спонтанных мутантов и их селекция.

152 Хранение под минеральным маслом Хранение под минеральным маслом широко используется для бактерий и микроскопических грибов. Это метод обеспечивает довольно длительное сохранение жизнеспособности и стабильности микроорганизмов. Масло предотвращает высыхание среды, замедляет процессы метаболизма и позволяет увеличить время между пересевами. Микроорганизмы выращивают на оптимизированной агаризованной питательной среде: аэробные микроорганизмы – на поверхности коротко скошенной (под углом 45 °) среды, анаэробы – в толще среды (посев уколом или в расплавленную среду с перемешиванием).

153 После того как культуры хорошо разовьются, их заливают маслом. Как правило, аспорогенные бактерии заливают через 2-7 суток после посева в зависимости от скорости роста микроорганизма, бациллы и актинонимицеты – в стадии сформировавшихся покоящихся форм. Дрожжи рекомендуется заливать маслом через 4-10 суток, мицелиальные грибы – через 7-12 суток.

154 Наиболее пригодно для заливки культур микроорганизмов высокоочищенное медицинское вазелиновое масло с плотностью 0,8-0,9. Предварительно масло стерилизуют автоклавированием, а затем для удаления влаги прогревают в сушильном шкафу при температуре не выше 150 °C или оставляют на двое - трое суток при комнатной температуре. Культуры заливают маслом так, чтобы слой его не превышал 1 см над средой или верхним краем скошенной среды, и сохраняют при комнатной температуре либо в холодильнике при 4-6 °C.

155 Для пересева клетки из-под масла отбирают петлей и, удалив излишки масла проведением петли по стенке пробирки, переносят на свежую питательную среду. Рекомендуется использовать ту же среду, на которой культуру хранили. Многие микроорганизмы в первом пассаже после хранения под маслом развиваются медленнее, однако при последующих пересевах скорость роста их восстанавливается. Метод хранения микроорганизмов под вазелиновым маслом прост, удобен в обращении, может быть использован в любой лаборатории. К недостаткам его можно отнести возможность инфицирования помещения микроорганизмами за счет разбрызгивания масла при обжигании петли, а также необходимость специальной очистки посуды от масла.

156 Хранение в лиофилизированном состоянии Хранение лиофильновысушенных клеток широко распространенный метод длительного сохранения микроорганизмов. Лиофилизацией (или сублимацией) называют процесс высушивания под вакуумом замороженных клеток. При этом вода удаляется из замороженного материала путём испарения льда, минуя жидкую фазу. Предварительное замораживание материала проводят в морозильных камерах при t от -40 до -60 °C или при помещении материала в смесь спирта с сухой углекислотой (t -78 °C), чем избегают вспенивания препарата в процессе лиофильной сушки. Замороженный материал в ампулах или флаконах быстро переносят в сушильную камеру (сублиматор), в которой создается глубокий вакуум и поддерживается пониженная температура (до -40°С).

157 Существуют аппараты, в которых предварительное замораживание препаратов осуществляется непосредственно в сублимационной камере. В результате сублимации свободная вода удаляется с поверхности замороженного материала, препарат переходит из твердого (замороженного) состояния в сухое (пористая масса, почти не измененная в объеме). Досушивание объекта проводят в этой же камере при t до 20 °C и выше. При этом из препарата удаляется связанная вода. После окончания лиофильной сушки вакуумный насос выключают и в камеру через фильтр подают стерильный сухой воздух или азот.

158 Лиофильновысушенные клетки сохраняют в ампулах, запаянных под вакуумом. Применение этого метода позволяет в течение и более лет сохранить без заметных изменений жизнеспособность, морфологи- ческие, культуральные, физиологические свойства, а также биохимическую активность клеток. Микроорганизмы, подлежащие лиофилизации, выращи- вают в оптимальных условиях до начала стационарной фазы роста или окончания формирования покоящихся форм. Затем клетки или соответственно покоящиеся формы суспендируют в специальных жидкостях, полу- чивших название защитных сред. В состав защитных сред входят различные вещества, которые предохраняют клетки от повреждений в период замораживания и высушивания (альбумин, обезжиренное молоко, желатин, пептон, сахароза, сорбит, поливинилпирролидон, глутамат натрия и их комбинации и др.).

159 Для успешной лиофилизации плотность в защитной среде должна быть как можно более высокой – клеток в 1 мл. Полученную суспензию разливают в ампулы из нейтрального стекла по 0,5-1,0 мл, замораживают, затем высушивают и запаивают под вакуумом. Остаточная влажность лиофилизированных клеток колеблется от 1 до 6% и определяется составом защитной среды и режимом высушивания. В различных лабораториях режимы замораживания и высушивания заметно варьируют и во многом зависят от имеющегося оборудования. Ампулы с лиофильновысушенными клетками рекомен- дуется сохранять в темноте при температуре 4-6 °C. Хранение при более высокой температуре, особенно превышающей °C, заметно снижает выживаемость клеток.

160 Для реактивации к лиофилизированным клеткам добавляют по каплям стерильную или водопроводную воду в количестве 0,5-1,0 мл и после регидратации высевают на богатые питательные среды. Лиофилизацию широко применяют для длительного хра- нения различных микроорганизмов. Тем не менее, этот метод нельзя считать универсальным. Следует отметить, что к лиофилизации более устойчивы грамположи- тельные, чем грамотрицательные бактерии. Очень плохо переносят ее фототрофные и хемолитотрофные бактерии, микоплазмы, многие облигатные анаэробы. Выживаемость спор после лиофилизации значительно выше, чем вегетативных клеток. Дрожжи с мелкими клетками и аскоспорами родов Pichia и Hansenula выдерживают лиофилизацию лучше, чем слабоспорулирующие или неспорулирующие крупные клетки дрожжей родов Saccharomyces, Kluyveromyces, Rhodotorula.

161 Хранение при низких и сверхнизких температурах Криоконсервация. Хранение микроорганизмов в замороженном состоянии при низких и сверхнизких температурах по сравнению с другими методами характеризуется наибольшей универсальностью. Однако этот метод требует специального оборудования и большой осторожности в работе с жидким азотом, поэтому используется лишь для сохранения микроорганизмов, не выдерживающих лиофилизацию.

162 Известны способы длительного хранения микроорганизмов при низких температурах от -20 до -196 °C. Многие микроорганизмы могут храниться в холодильниках при температуре ниже -60 °C с сохранением высокого титра клеток. Однако в коллекциях микроорганизмов, особенно международных, этот прием используется как один из этапов лиофилизации культур. Используется также метод низкотемпературного замораживания на носителях, что позволяет увеличить срок хранения микроорганизмов до 5 и более лет.

163 Низкотемпературная консервация микроорганизмов в последние годы получила широкое распространение в связи с доступностью низкотемпературных холодильников, способных надежно поддерживать низкие температуры в течение длительного времени. Однако время хранения биоматериала при этих температурах все же ограничено: для разных видов бактерий в холодильнике при -70 °C находится в пределах месяцев. Для низкотемпературного хранения сложных по составу ассоциаций микроорганизмов существует реальная опасность потери их в течение 2-4 лет, а возможно, и ранее.

164 Для защиты от повреждающего действия низких температур клетки предварительно суспендируют в растворах криопро- текторов. Криопротекторы – вещества, способные предотвращать развитие повреждений биологических объектов при охлаждении, замораживании и последующем отогреве. К настоящему времени известно свыше 100 соединений, которые возможно использовать в качестве криопротекторов (спирты, амины, аминокислоты и их амиды, углеводы, белки, природные и искусственные полимеры, соли и др.).

165 Однако все известные криопротекторы могут оказывать на клетки токсическое действие, величина которого зависит от температуры и длительности экспозиции клеток с криопротектором. Поэтому, как правило, сразу после оттаивания клеток криопротектор удаляют из среды путем последовательных отмываний центрифугированием. В качестве криопротекторов в микробиологии обычно используют 10, 15, 20 % растворы глицерола; 5, 7.5, 10 % растворы диметилсульфоксида (ДМСО); 12, 20, 24 % растворы сахарозы, а также глицерол и ДМСО в сочетании с глюкозой или сахарозой.

166 Хранение в глицероле. Одним из самых удобных методов хранения микроорганизмов является их содержание при низких и сверхнизких температурах в растворах глицерола, который служит криопротектором. Данный способ широко распространен, однако не все микроорганизмы выдерживают такую обработку. Поэтому считается, что для клеток, подвергаемых замораживанию в глицероле, необходимы предварительные эксперименты по определению степени выживаемости. Наибольшее распространение это способ консервации микроорганизмов получил при хранении суспензий различных спор.

167 Для проведения экспериментов по хранению готовят 50%- ный раствор глицерола в дистиллированной воде и стерилизуют. Клетки выросшей культуры (обычно середины экспоненциальной фазы роста), предназначенные для хранения, смешивают в пропорции 1:1 с 50%-ным глицеролом, перемешивают и ставят в морозильник. Хранить суспензии удобно в стерильных пробирках Эппендорфа. Из сохраняемых клеток периодически (2-6 раз в год) отбирают пробы для проверки на выживаемость. В зависимости от результатов проверки рассчитывают схемы консерваций той или иной культуры и периодичности их пересева.

168 Независимо от природы криопротектора во всех случаях при подготовке культуры к криоконсервации суспензию клеток с высокой плотностью ( клеток в 1 мл) разливают в ампулы (или во флаконы с завинчивающейся крышкой). Ампулы запаивают и помещают в холодильник с температурой -70 °C, а затем переносят в жидкий азот, где и сохраняют при -196 °C. Оттаивание замороженных клеток должно быть как можно более быстрым. Поэтому ампулы погружают на 2 мин в водяную баню с температурой °C. Клетки из ампул высеваются на богатые питательные среды. Необходимо помнить, что при температуре хранения от -20 до -40 °C хорошо выживают немногие микроорганизмы; значительно эффективнее хранение при -70 °C в твердой углекислоте и особенно в условиях сверхнизких температур: при -196 °C (жидкий азот) или при -210 °C (газовая фаза жидкого азота).

169 Хранение в дистиллированной воде или 1%-ном растворе хлорида натрия Хранение микроорганизмов в дистиллированной воде или 1%-ном растворе хлорида натрия не требует специального оборудования и доступно любому экспериментатору. Микроорганизмы предварительно выращивают в оптимальных условиях, после чего клетки суспендируют в дистиллированной воде или 1%-ном растворе хлорида натрия. Успешному сохранению клеток способствует высокая плотность суспензии – не менее клеток в 1 мл. Суспензию разливают в стерильные пробирки или флаконы и сохраняют в холодильнике или при комнатной температуре. Оставлять на хранение рекомендуется клетки начала стационарной фазы роста культуры или сформировавшиеся покоящиеся формы – споры, цисты.

170 Хранение в высушенном состоянии на адсорбентах Этот метод применяют главным образом для актиномицетов, микроскопических грибов и анаэробных бактерий, образующих споры. В качестве адсорбентов используют почву, кварцевый песок, силикагель, вату, фильтровальную бумагу. Разработанной стандартной техники это способ не имеет. В самом общем виде все сводится к тому, что стерильный адсорбент, помещенный в ампулы, смешивают с густой суспензией клеток и высушивают под вакуумом или при комнатной температуре. Затем ампулы запаивают и хранят при комнатной температуре или в холодильнике. Имеются данные, что у актиномицетов после хранения в почве или в кварцевом песке восстанавливаются некоторые таксономические признаки (окраска воздушного и субстратного мицелия), которые были утрачены в процессе длительного культивирования в лаборатории.

171 Оценка жизнеспособности микроорганизмов после длительного хранения Жизнеспособность микроорганизмов после различных сроков хранения определяют путем высева их на богатые питательные среды с последующим подсчетом выросших колоний. Процент выживаемости микроорганизмов определяют по отношению числа сохранившихся клеток к первоначальному числу жизнеспособных клеток (до начала хранения), принятому за 100%.

172 Питательные среды Классификация питательных сред По составу: 1) натуральные содержат продукты растительного либо животного происхождения неопределенного качественного и количественного состава; 2) синтетические содержат только химически чистые соединения в оптимальном количественном соотношении (например, глюкозо-солевая питательная среда). Натуральные среды – эмпирически подобранные питательные среды природного происхождения, состав которых точно неизвестен (к ним относятся пептоны, приготавливаемые из частично гидролизованного белка, гидролизаты и экстракты растительного и животного происхождения).

173 Выбор питательной среды зависит в значительной степени от цели эксперимента. Многие исследователи (Герберт) настойчиво высказывались за повсеместное использование синтетических питательных сред. Однако следует признать, что они обладают рядом практических неудобств. 1) Микроорганизмы, выращенные на таких питательных средах, обычно фенотипически отличаются от выращенных на питательных средах естественного происхождения (например, по составу и по скорости деления). 2) Размножение микроорганизмов на таких средах обычно легче подавляется избыточной аэрацией или токсическими веществами; они также более чувствительны к нарушениям баланса между некоторыми составными частями питательной среды, особенно аминокислотами. 3) Многие бактерии нуждаются в большом числе факторов роста, и для некоторых из них до сих пор не найдены искусственные среды, на которых они могли бы размножаться. Возможно, что все эти неудобства со временем будут преодолены, но пока среды неизвестного состава используются весьма широко, хотя они и вносят в эксперимент неконтролируемые факторы.

174 По назначению: 1) основные – служат для культивирования большинства микроорганизмов (МПБ, МПА, бульон и агар Хоттингера, пептонная вода); 2) специальные – служат для выделения и выращивания микроорганизмов, не растущих на простых средах; 3) элективные (избирательные) – служат для выделения определённого вида или группы видов микроорганизмов, росту которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих микроорганизмов. Элективные среды обеспечивают преимущественное развитие одного или целой физиологической группы микроорганизмов. Например, для преимущественного выделения грамотрицательных бактерий бывает достаточным добавления в питательную среду трифенилметановых красителей (кристаллический фиолетовый, малахитовый зеленый и т. д.). Для выделения стафилококков в среду может быть добавлен хлористый натрий в концентрации 7,5 %. К элективным относят среды, содержащие антибиотики, соли, измененный pH, соли желчных кислот и др.; 4) дифференциально-диагностические – служат для идентификации определенных микроорганизмов на основании исследования их физиолого-биохимических особенностей.

175 Элективная солевая среда Среда предназначена для селективного выделения Staphylococcus aureus из клинических образцов. Микроорганизмы, сбраживающие манит, формируют на данной среде колонии желтого цвета. Высокая концентрация хлорида натрия ограничивает рост других бактерий.

176 Шоколадный агар с факторами роста Шоколадный агар с добавлением смеси ростовых факторов предназначен для выделения и культивирования прихотливых микроорганизмов, принадлежащих к родам Neisseria, Haemophilus и Streptococcus (S. pneumoniae).

177 Среда Плоскирева Среда Плоскирева предназначена для селективного выделения и дифференциации Salmonella и Shigella из клинических образцов.

178 Цетримидный агар Среда для селективной изоляции и идентификации Pseudomonas aeruginosa.

179 Среда Эндо Среда для выделения Escherichia coli. В состав среды входит агар, лактоза ( или сахароза ) и индикатор конго-красный.

180 Среда Левина Среда с эозином и метиленовым синим. Среда предназначена для дифферентации Enterobacteriaceae.

181 Селективная хромогенная среда для Salmonella

182 Хромогенная среда для E.coli

183 Хромогенный агар MМ для сальмонелл Рост на среде Escherichia coli (зеленые), Salmonella серовара Enteritidis (с черным центром) и Citrobacter freundii (бесцветные)

184 Среды Гисса Среда Гисса содержат индикаторы водорастворимый голубой и аурин (розоловую кислоту); они предназначены для изучения биохимических свойств выделенных культур энтеробактерий (цветной ряд)

185 По консистенции: 1) жидкие; 2) полужидкие; 3) твердые; 4) сыпучие. Жидкие среды (мясопептонный бульон, сахарный бульон) уплотнитель не содержат, плотные содержат уплотнитель в концентрации 1-2% (мясопептонный агар), Полужидкие – в концентрации 0,2-0,7%. Для получения плотной консистенции к жидкой среде добавляют обычно агар-агар - полисахарид, добываемый из красных морских водорослей, или желатин - вещество белковой природы животного происхождения.

186 Требования, предъявляемые к средам 1) быть питательными, т. е. содержать в легко усвояемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей. Ими являются источники органогенов и минеральных (неорганических) веществ, включая микроэлементы. Многие микроорганизмы нуждаются в так называемых факторах роста, к которым относятся витамины, пурины, пиримидины и аминокислоты. Чтобы подчеркнуть потребность микроорганизмов в факторах роста, принято использовать термин прототрофы и ауксотрофы. Прототрофы не нуждаются в факторах роста, для ауксотрофов абсолютно необходимо наличие в среде одного или нескольких факторов роста.

187 2) иметь оптимальную концентрацию водородных ионов рН, так как только при оптимальной реакции среды, влияющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества. Для большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (рН 7,27,4). Исключение составляют холерный вибрион его оптимум находится в щелочной зоне (рН 8,59,0) и возбудитель туберкулеза, нуждающийся в слабокислой реакции (рН 6,26,8). Чтобы во время роста микроорганизмов кислые или щелочные продукты их жизнедеятельности не изменили рН, среды должны обладать буферностью, т. е. содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена;

188 3) быть изотоничными для микробной клетки, т. е. осмотическое давление в среде должно быть таким же, как внутри клетки. Для большинства микроорганизмов оптимальна среда, соответствующая 0,5% раствору натрия хлорида; 4) быть стерильными, так как контаминанты препятствуют росту изучаемого микроорганизма и изменяют свойства среды (состав, рН и др.); 5) плотные среды должны быть влажными и иметь оптимальную для микроорганизмов консистенцию;

189 6) обладать определенным окислительно- восстановительным потенциалом, т. е. соотношением веществ, отдающих и принимающих электроны, выражаемым индексом RH2. Этот потенциал показывает насыщение среды кислородом. Для одних микроорганизмов нужен высокий потенциал, для других низкий. Например, анаэробы размножаются при RH2 не выше 5, а аэробы при RH2 не ниже 10; 7) быть по возможности унифицированными, т. е. содержать постоянные количества отдельных ингредиентов.

190 Известно очень много питательных сред для культивирования микроорганизмов (более двухх тысяч наименований было классифицировано Левином и Шенлейном еще в 1930 г.), но число ингредиентов, являющихся их неотъемлемыми компонентами, относительно невелико. Однако качественный диапазон этих сред весьма широк – от растворов неорганических солей, на которых могут расти автотрофы, до сложных питательных сред, приготавливаемых из мясных гидролизатов, обогащенных кровью или сывороткой.

191 Основу питательных сред для культивирования микроорганизмов составляют источники углерода. Исключительное многообразие микроорганизмов делает число таких соединений почти безграничным, так как, с одной стороны, существуют культуры (гетеротрофы), способные при осуществлении биосинтеза потреблять углерод только из высокоорганизованных молекул, например белков и пептидов, а с другой – многие (автотрофы) бактерии и отчасти дрожжи утилизируют такие простейшие углеродсодержащие соединения, как метан, метанол и даже углекислота.

192 Кроме углерода клетки микроорганизмов в процессе роста испытывают необходимость в источниках азота, фосфора, макро- и микроэлементов. Все вещества этого ряда находятся в питательных средах в виде солей, исключением являются лишь среды, где азот и фосфор могут усваиваться растущими культурами из органических источников, например автолизатов или гидролизатов микробного или животного происхождения. Строго паразитические виды бактерий размножаются только в присутствии нативного белка. Потребность в кислороде и водороде бактерии удовлетворяют главным образом за счет поступающей в клетку воды.

193 Среды для культивирования микроорганизмов кроме соединений, необходимых для процессов биосинтеза, должны включать и энергетические субстраты. По способу получения энергии все микроорганизмы делят на две основные группу: хемотрофы и фототрофы.

194 ОБОРУДОВАНИЕ, ИСПОЛЬЗУЕМОЕ ПРИ РАБОТЕ С МИКРООРГАНИЗМАМИ Оборудование для очистки воды Качество воды имеет важное значение не только для приготовления питательных сред, но и для мытья культуральной посуды. До недавнего времени такая вода приготавливалась путем простой и двухкратной дистилляции питьевой воды. В настоящее время наряду с традиционными широкое применение получили методы очистки воды путем использования физико- химических процессов обратного осмоса, ионного обмена и мембранной фильтрации. Водопроводная вода, используемая в качестве исходной и прошедшая в этих установках через очистку обратным осмосом, поступает на фильтры из активированного угля, с них – на колонки с ионообменными смолами и затем на мембранные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. При необходимости вода дополнительно подвергается воздействию мощного потока УФ облучения. Для очистки воды подобным способом наиболее часто применяются установки типа ОВ-1, состоящие из двухх конструктивно самостоятельных частей, допускающих независимое использование – ОВ-2 и ОВ-3. Установка ОВ-2 осуществляет приготовление общелабораторной воды, превосходящей по качеству очистки дистиллированную воду. Установка ОВ-3 предназначена для получения пригодной для приготовления питательных сред сверхчистой из общелабораторной или дистиллированной воды.

195 Приборы и аппараты для мытья и стерилизации посуды Приборы и аппараты для мытья и стерилизации посуды обеспечивают выполнение всех этапов технологического процесса: 1) предварительную стерилизацию посуды, поступающей из опыта, насыщенным водяным паром в паровых стерилизаторах (автоклавах); 2) предварительное замачивание в водных растворах химических реагентов (5 % растворе гипохлорита натрия, 3 % растворе перекиси водорода и т. д.); 3) полоскание после замачивания холодной или слегка нагретой водой; 4) мытье горячим раствором детергента с низким пенообразованием; 5) вторичное полоскание горячей водой; 6) финишное полоскание дистиллированной или общелабораторной водой; 7) сушку в сушильных шкафах с принудительной продувкой горячим воздухом; 8) упаковку и финишную стерилизацию в паровых или воздушных стерилизаторах. Оптимальным вариантом для мытья посуды является использование автоматических моечных машин («Forma Scientific», «Miele», «Hotpack-Heinicke».

196 Приборы для дозирования, разведения и пробоотбора В практике работ с клеточными культурами постоянно возникает необходимость массового дозирования, пробоотбора или разведения биологически активных жидкостей. Для этого используются автоматические или полуавтоматические устройства, называемые в различных источниках дозаторы-дилюторы, автоматические пипетки и т. п. Одним из основных требований к такого рода приборам является отсутствие контакта между дозируемым раствором и частями конструкции дозатора. Данным требованиям отвечают полуавтоматические шприцевые дозаторы и автоматические шприцевые дозаторы, которые производят разведение или дозирование одновременно по одному, двухм и более каналам и могут работать как в автоматическом, так и полуавтоматическом режимах. Все указанные типы устройств предполагают использование сменных наконечников, которые могут подвергаться паровой стерилизации и повторно использоваться.

197 Пипетки лабораторные и дозаторы пипеточные типа производят полуавтоматическое дозирование биологически активных жидкостей и поставляются в наборах из 1-3 моделей. Величина дозы задается пользователем в определенном диапазоне (2-20 мкл, мкл, мкл). Комплект дозаторов может включать 8 моделей, каждая из которых обеспечивает выдачу 2 фиксированных по объему доз (от 5 до 1000 мкл). Комплект дозаторов может включать 5 моделей, настроенных на 1 фиксированную дозу (от 20 до 500 мкл).

198 Механические дозаторы лабораторные (автоматические пипетки): механический степпер и механические дозаторымеханический степпермеханические дозаторы

199 Электронные дозаторы лабораторные (автоматические пипетки электронные)

200 Описанные выше приборы позволяют работу с жидкостями, нагретыми до 40 °C и имеющими вязкость, близкую к вязкости воды. Тем самым не обеспечивается дозирование питательных сред на основе агара, которые для придания им малой вязкости должны быть нагреты до температуры не менее 60 °C. В таких случаях используются приборы типа «Агар». Этот аппарат для разлива питательных сред, состоящий из перистальтического насоса-дозатора и разливочного механизма, обеспечивает автоматическое одновременное заполнение в течение 1 минуты 16 стеклянных чашек Петри диаметром 100 мм, находящихся в специальных планшетах. Стерильные условия в аппарате поддерживаются путем УФ облучения его внутреннего объема.

201 В экспериментах также применяются устройства малой лабораторной техники, не являющиеся по своей сути дозаторами, но способные облегчить этот процесс. Это так называемые приборы «Pipet-Aid» (фирмы «Flow», «Bellco», «Cole-Parmer» и другие), предназначенные для пробоотбора и выдачи дозы при работе с пипетками Пастера и любыми градуированными пипетками емкостью до 75 мл. Пипетка вставляется в специальный держатель, соединенный с малогабаритным вакуумным насосом, находящимся либо непосредственно в держателе, либо автономно. Управление работой прибора производится нажатием кнопок, размещенных на держателе.

202 Устройства для приготовления и стерилизации питательных сред Одним из главных требований к питательным средам для клеточных культур является их стерильность, достигаемая разными способами, включая и так называемую стерилизующую фильтрацию, освобождающую жидкие питательные среды от примесных частиц, бактерий и коллоидов. Под стерилизацией сред обычно понимают любой метод воздействия, обеспечивающий удаление из них микроорганизмов-контаминантов или разрушение последних. На практике главная цель стерилизации достижение стерильности, но сохранение качества питательной среды также имеет важное значение, так как непосредственно от этого будет зависеть результат процесса культивирования.

203 Длительность экспозиции, или время выдержки это тот временной интервал, в пределах которого погибают микроорганизмы. Гибель последних спор в среде является случайным процессом, поэтому введено понятие «критерий стерильности» отношение числа операций стерилизации, в результате которых выжили по одной термостойкой споре, к общему числу проведенных операций. Для стерилизации сред принимают критерий стерильности, равный 0,01 ± 0,001. Если исходное количество спор в среде принять N 0, то получим соотношение N/N 0 уровень стерильности, или коэффициент выживания, который означает, что для достижения заданного критерия стерильности (например 0,01) среда должна выдерживаться при температуре стерилизации строго определенное время, чтобы «популяция» спор снизилась от исходного значения N 0 до N/N 0.

204 Сыпучие и твердые среды, используемые в настоящее время для получения ферментов поверхностным методом и кормовых добавок, стерилизуют паром, инфракрасными лучами, а также используют другие факторы. Компонентами таких сред являются отруби, биошрот, свекловичный жом, древесные опилки, солома. Компоненты предварительно тщательно измельчают и смешивают в оптимальных соотношениях. Для стерилизации газовых потоков (в первую очередь воздуха) используют процесс фильтрации через специальные фильтры с последовательно расположенными фильтрующими элементами, каждый из которых обеспечивает заданную степень снижения концентрации клеток в газовом потоке. Общее количество фильтров определяется необходимым уровнем (критерием) стерилизации. Фильтрующий материал периодически стерилизуется подачей острого пара в отключенный фильтр через заданные промежутки времени. Жидкостные потоки стерилизуют различными методами, из которых практический интерес представляют термический, радиационный, фильтрационный и отчасти химический.

205 Термический - самый распространенный, при температурах порядка оС. Основным недостатком термической стерилизации, несмотря на ее широкое практическое использование, следует считать неизбежные потери питательных свойств среды, поскольку при температурах, необходимых для стерилизации, большинство субстратов, особенно углеводы, оказываются термически нестабильными. Радиационный - γ-излучение, дает хорошие результаты при стерилизации небольших объектов, однако применяется редко из-за трудностей эксплуатации мощных источников этого излучения. В отдельных случаях применяют химические стерилизующие агенты (вещества с ярко выраженным асептическим действием). Основная проблема в этом случае - необходимость устранения стерилизующего агента из питательной среды после гибели микрофлоры до внесения инокулята. Химические антисептики должны быть не только высокоэффективны, но и легко разлагаемы при изменении условий после завершения стерилизации. К числу лучших относится пропиолактон, обладающий сильным бактерицидным действием и легко гидролизуемый в молочную кислоту.

206 Метод фильтрации является идеальным для стерилизации термически неустойчивых жидких и газовых сред, поскольку может осуществляться при низкой температуре и требует лишь градиента давления по разные стороны мембраны. Основная трудность - наличие термостойких мембран, способных выдерживать многократную стерилизацию их самих. Следует различать микро- и ультрафильтрацию сред. При микрофильтрации из жидкости удаляются частицы примесей и бактерий размерами от 0,25 до 10 мкм. Ультрафильтрация приводит к извлечению из раствора очень мелких частиц и коллоидов, а также молекул растворенных веществ с молекулярными массами от 1 тысячи до 1 миллиона. Процесс микрофильтрации осуществляется пропусканием жидкости через мембранные или глубинные фильтры. Для очистки питательных сред пригодны мембранные фильтры, производимые фирмами «Millipore», «Sartorius», «Shleiher-Shull» и другие. В общем случае установка для стерилизующей фильтрации состоит из системы создания избыточного давления на фильтруемую жидкость, стерильного держателя фильтра, фильтрующей мембраны, трубопроводов и сосудов для размещения фильтруемой жидкости и фильтрата. Величина избыточного давления зависит от размера пор и площади мембраны.

207 Ряд субстратов не требует стерилизации, так как они сами обладают асептическим действием; сюда относят метанол, этанол, концентрированная уксусная кислота и др. В этом случае ограничиваются стерилизацией прочих элементов питательной среды.

208 Помещения для работы с культурами клеток Все манипуляции при работе с клеточными культурами, проводится в боксовых помещениях или в ламинар-боксах. Боксовое помещение представляет собой изолированную комнату с несорбирующими пыль моющимися покрытиями, имеющую предбоксник и обеспеченную необходимым общим и специальным освещением, системами приточной и вытяжной вентиляции, холодным и горячим водоснабжением, а также подводами газов и сжатого воздуха. Альтернативой боксовым помещениям, требующей меньших затрат на оборудование, являются ламинар- боксы или стерильные рабочие места. В этом случае в любом помещении может быть создан локальный стерильный объем, необходимый для работы и создающий биологическую защиту пользователей.

209 Разные типы ламинар-боксов предназначены для размещения в любых помещениях, имеющих приточную вентиляцию с грубой предварительной очисткой воздуха. Технически задача решается путем постоянного обдува места проведения работ ламинарным потоком. При работе с заведомо непатогенными материалами поток обеспыленного воздуха из рабочей зоны выходит непосредственно в окружающее пространство. В случае работы с потенциально патогенным материалом воздух перед выходом из рабочей зоны дополнительно фильтруется, возможность обдува оператора при этом исключена. В зависимости от устройства ламинар-бокса поток обеспыленного воздуха в рабочей зоне может быть горизонтальным, вертикальным или наклонным.

210 Ламинар-бокс с горизонтальным потоком обеспыленного воздуха обеспечивает очистку воздуха, подаваемого в рабочую зону, путем фильтрации на фильтрах грубой и тонкой очистки, встроенных в прибор (по мере загрязнения грубый фильтр промывается, тонкий сменяется). Прибор имеет встроенные источники освещения, УФ облучения (для стерилизации рабочей зоны в перерывах между использованием бокса) и регулятор скорости воздушного потока. Организация ламинар-боксов с вертикальным и наклонным потоком обеспыленного воздуха аналогична организации ламинар-бокса с горизонтальным потоком, описанной выше.

211 Ламинар-бокс для работ с потенциально патогенными культурами имеет некоторые отличия. В приборе обеспечивается рециркуляция воздушного потока, заключающаяся в том, что воздух из рабочего объема попадает на специальный фильтр тонкой очистки, откуда часть его выходит в окружающее пространство, а остальной поток повторно проходит через фильтр тонкой очистки и вновь поступает в рабочий объем. Этим достигается невозможность выноса обрабатываемого материала в помещение. Прибор имеет встроенные источники света и УФ облучения, столешницу из нержавеющей стали. Передняя часть рабочего объема закрыта прозрачным стеклом, перемещаемым по высоте. Бокс снабжен системой регулирования скорости потока воздуха и индикаторами загрязнения фильтра тонкой очистки.

212 Оборудование культуральных лабораторий Лабораторные термостаты Лабораторные термостаты для культивирования клеток должны отвечать ряду специальных требований: 1) обеспечивать высокую стабильность поддержания заданной температуры, 2) создавать минимальный градиент температуры по полезному объему, 3) обладать системой быстрого восстановления температуры после кратковременного открывания полез- ного объема, 4) внутренний объем должен изготавливаться из биологически пассивных материалов, т. е. не влияющих на жизнедеятельность клеток и стойких к воздействию компонентов питательных сред. Материалы и покрытия внутренних и наружных частей конструкции термостата должны позволять деконта- минацию растворами спирта ректификата и стерилизацию УФ облучением.

213 По своей конструкции лабораторные термостаты подразделяются на жидкостные и воздушные. В жидкостных термостатах полезный объем окружен емкостью, заполненной дистиллированной водой, которую собственно и нагревают. Жидкостные термостаты обеспечивают малые значения температурного градиента в камере, но имеют очень большую тепловую инерцию и поэтому длительное время вхождения в рабочий режим. Воздушные термостаты имеют полезный объем, непосредственно контактирующий с электронагре- вательными элементами. Усовершенствованные формы воздушных термостатов, ранее уступавших жидкостным по ряду основных параметров, теперь составляют значительную часть серийно выпускаемых моделей.

214 СО 2 - инкубаторы Необходимость поддержания постоянной величины рН в питательной среде и ее минимального испарения в период инкубации клеток привела к разработке специальных приборов, аналогичных описанным выше термостатам. Главным отличием является наличие систем создания и поддержания определенного состава газовой среды в полезном объеме и высокой относительной влажности в нем. Это так называемые углекислотные инкубаторы, выпускаемые фирмами «Heraues», «Hotpack», «Flow». Газовая среда в камерах СО 2 - инкубатора содержит повышенную концентрацию кислорода и углекислого газа, а в большинстве случаев только углекислого газа. Величина концентрации задается по условиям культивирования и поддерживается автоматически. В автоматических СО 2 - инкубаторах заданный состав газовой среды поддерживается дозированным поступлением нужного газа в поток очищенного от пыли внешнего воздуха, подаваемого во внутренний объем прибора. Другой разновидностью инкубаторов являются так называемые газо- проточные инкубаторы, где подача нужных газов производится непрерывно, а точное процентное содержание достигается изменением скорости протока.

215 Лабораторные встряхиватели Большое значение в оснащении культуральной лаборатории имеют приборы, обеспечивающие принудительное перемешивание питательных сред с помещенными в них микробными клетками, обеспечивая лучший газообмен, и, тем самым, повышая эффективность культивирования. Большинство моделей встряхивателей позволяет перемешивание в одном режиме – вращательном или возвратно-поступательном. Хотя наиболее современные модели (фирма «Infors») являются универсальными, т. е. работают в разных режимах перемешивания.

216 Лабораторные ферментеры Это комплексы приборов и аппаратов для массового суспензионного или глубинного культивирования микробных культур. В общем случае ферментер состоит из культивационного сосуда, насосов и соединительных трубопроводов (для подачи питательной среды, газов, инокулята и отбора продукта), измерительных приборов и регуляторов, управляющих температурой среды в сосуде, ее рН, окислительно-восстановительным потенциалом и другими параметрами. Биореакторы должны удовлетворять следующим требованиям: полная герметизация, исключающая попадания посторонней микрофлоры; сохранение постоянного объема культуральной жидкости, удобство при чистке всех частей аппарата и внутренней поверхности, а также удобство стерилизации.

217 Части ферментеров, контактирующие с питательной средой (сосуды, соединительные трубопроводы, насосы и др.), изготавливаются из биологически пассивных, химически стойких материалов, позволяющих производить стерилизацию насыщенным водяным паром (качественная нержавеющая сталь, фторопласт, боросиликатное стекло, силиконовая резина).

218 Сосуды ферментеров имеют цилиндрическую (реже коническую) форму. В них размещены датчики, а также система для аэрации питательной среды, производимой барботированием газов (подача газов снизу через барботер) или сочетанием продувки газов с механическим перемешиванием среды. При использовании механических мешалок их соединение с приводным двигателем производится при помощи магнитных муфт, что снижает риск загрязнения питательной среды. Помимо механического и пневматического перемешивания используются также системы циркуляционного (гидродинамического) перемешивания направленным током жидкости по замкнутому контуру при помощи насосов.

219 К важнейшим факторам, определяющим устройство реактора, относятся: агрегатное состояние исходных веществ и целевых продуктов, а так же их биохимические и микробиологические свойства; температура и давление, при которых протекает процесс; тепловой эффект процесса и скорость теплообмена; интенсивность массообмена, перемешивания реагентов; непрерывность или периодичность процесса; удобство монтажа и ремонта аппаратуры, простота его изготовления; доступность конструкционного материала и т.д.

220 В зависимости от конструктивных решений, объемов и других характеристик биореакторы делят на группы. На основе рабочего объема биореакторы делятся на лабораторные (их емкость 0,5-100 л), пилотные (100 л -10 м 3) и промышленные ( м 3). Во всех случаях питательной средой заполняется не более 75 % объема сосуда. Все биореакторы могут быть разделены по используемому принципу культивирования на закрытые и открытые. В закрытых биореакторах осуществляют периодическое культивирование, иногда его называют накопительным культивированием.

221 По способу подачи воздуха в биореактор их можно разделить на 2 типа: без подводки стерильного воздуха (в таких биореакторах культивируют анаэробные микроорганизмы); с подводкой стерильного воздуха (их используют для культивирования аэробов). Аэрация жидкости в биореакторах может обеспечиваться механическими мешалками или потоком воздуха.

222 Ферментеры можно подразделить в зависимости от системы перемешивания на три основные группы : аппараты с механическим, барботажным, эрлифтным перемешиванием.

223 Биореакторы с механическим перемешиванием характеризуются тем, что воздух подают под давлением через распределитель, представляющий собой кольцо с множеством маленьких отверстий. При этом образуются мелкие пузырьки воздуха и за счет механического перемешивания, обеспечивается их равномерное распределение внутри аппарата. Для этой же цели используются мешалки, которые, разбивая крупные пузырьки воздуха, разносят их по всему реактору. Эффективность распределения воздуха зависит от типа мешалки, числа ее оборотов и физико-химических свойств используемой среды. При интенсивном перемешивании часто случается вспенивание, поэтому рабочий объём биореакторов такого типа не превышает 55 %.

224 Биореакторы с барботажной системой воздухораспределения характеризуются тем, что перемешивание в них осуществляется восходящими потоками воздуха, который подают под высоким давлением в нижнюю часть биореактора через барботеры, представляющие собой воздушные трубы с отверстиями диаметром 0,1-0,2 мм. Подача воздуха под сильным давлением приводит к сильному пенообразованию, поэтому рабочий объем биореакторов такого типа также не превышает 55 %. Биореакторы с эрлифтной системой воздухораспределения характеризуются тем, что воздух подают через центральную трубу, которая обеспечивает внутреннюю циркуляцию жидкости, либо за счет внешней системы циркуляции, которая осуществляется также с помощью труб, установленных снаружи аппарата.

225 По конструкции биореакторы классифицируются следующим образом: реакторы емкостного типа; реакторы типа колонны; реакторы трубчатого типа; реакторы пленочного типа; реакторы мембранного типа; реакторы с псевдоожиженным слоем. Конструктивный тип реактора зависит от условий проведения процесса и свойств участвующих в нем компонентов.

226 Классификация ферментеров по способу подвода энергии: Ферментеры с подводом энергии газовой фазой (группа ФГ). Их общий признак – подвод энергии в аппарат через газовую фазу, которая является ее носителем. Ферментеры характеризуются достаточно простой конструкцией (отсутствуют трущиеся, движущиеся узлы), высокой эксплуатационной надежностью, но имеют не очень высокие массообменные характеристики. Данные аппараты представляют собой вертикальную емкость, снабженную газораспределительным устройством одного из известных типов. К таким аппаратам относятся, например, барботажные и эрлифтные ферментеры.

227 Ферментеры с вводом энергии жидкой фазой (группа ФЖ) наиболее сложны по конструкции и энергоемки, но обеспечивают наиболее высокие по сравнению с группой ферментеров ФГ значения коэффициента массопередачи кислорода. В данных аппаратах ввод энергии осуществляется жидкой фазой, обычно самовсасывающими мешалками или насосами; в последнем варианте жидкость вводится в аппарат через специальное устройство (сопло, эжектор, диспергатор). Данные аппараты также можно подразделит на типы: ферментеры с самовсасывающими мешалками не требуют специальных воздуходувных аппаратов, так как поступление в них воздуха происходит в результате разрежения в воздушной камере мешалки, соединенной с воздуховодом и с жидкостью, отбрасываемой лопатками мешалки;

228 в эжекционных ферментерах возможна рециркуляция газовой фазы, что экономит субстрат, однако требуется наличие специальных насосов для перекачки газосодержащей культуральной среды. Применение эжекционного ввода газовых субстратов в ферментер может интенсифицировать массообмен на порядок;

229 струйные ферментеры (с затопленной или падающей струей) оборудуются мощными насосами, которые забирают культуральную жидкость из нижней части аппарата. Струя жидкости под давлением свободно падает сверху и пронизывает аэрируемую жидкость до дна аппарата, интенсивно перемешивая жидкость. Внизу жидкость вновь засасывается насосом и снова подается вверх аппарата, то есть возникает замкнутый контур циркуляции. Недостатком данных аппаратов являются потери энергии при перекачке жидкости, трудности проектирования в связи с отсутствием надежных методик расчета конструкций и режимов работы струйных и эжекционных устройств.

230 Третья группа аппаратов – с подводом энергии газовой и жидкой фазами (группа ФЖГ). Основными их конструкционными элементами являются перемешивающие устройства всех известных типов, обеспечивающие высокоэффективное диспергирование и гомогенизацию, а также наличие в совокупности насосов и перемешивающих устройств. Это могут быть аппараты с группой самовсасывающих мешалок и насосом для перекачивания культуральной жидкости, высокоинтенсивные аппараты с механическим перемешиванием и одновременно барботажем сжатым воздухом и другие сочетания перемешивающих и аэрирующих устройств. Коэффициент массопереноса кислорода в таких ферментерах может в принципе иметь любые из известных значения.

231 Рис. Упрощенные схемы биоректоров различных типов А – реактор с механическим перемешиванием; Б – барботажная колонна; В – эрлифный реактор с внутренней циркуляцией; Г – эрлифный реактор с внешней циркуляцией. Стрелки – направление потока культуральной среды.

232 Ферментеры с вводом энергии жидкой фазой (группа ЖФ) а) с самовсасывающей мешалкой: 1 – корпус, 2 – мешалка, 3 – циркуляционный контур-теплообменник; б) эжекционный: 1 – корпус, 2 – насос, 3 – эжектор, в) струйный с затопленной струей: 1 – эжектор, 2 – теплообменник, 3 – корпус, 4 – насос, 5 – рассекатель, 6 – труба с насадкой, г) струйный с плавающей струей: 1 – теплообменник, 2 – насос, 3 – корпус, 4 – эжектор.

233 Ферментеры с подводом энергии газовой фазой (группа ФГ) а) барботажный: 1 – корпус, 2 – воздухораспределитель, 3 – карман, 4 – коллектор.

234 б) барботажный колонный: 1 – корпус, 2 – рубашка, 3 – воздухораспределитель, в) барботажно-эрлифтный: 1 – корпус, 2 – диффузор-теплообменник, 3 – воздухораспределитель

235 Известны следующие основные типы аппаратов отечественного производства: барботажный (трубчатый и коробчатый), эрлифтный (типовой), эрлифтно- периферийный, эрлифтно-многозонный, многозонной конструкции, колонный, горизонтальный с самовсасывающими мешалками, эжекционный, дрожжерастильный и другие. Из зарубежных моделей известны аппараты фирм «Лефрансуа» (Франция), «Хепос» (Чехия) и «Уде-Хекс» (Германия), концернов «ICI» и «БП» (Великобритания), колонный аппарат фирм «Мицубиси» (Япония) и «Ликвихимик биосинтез» (Италия), струйный аппарат «ИЦ» (Германия), аппарат системы «Фогельбуша» (Австрия), шаровой аппарат фирмы «Хемап» (Швейцария) и другие.

236 Большинство перемешиваемых и аэрируемых культур во время роста образуют довольно много пены. Образование на поверхности среды культивирования слоя из пузырьков связано с наличием в среде поверхностно-активных веществ (ПАВ), Умеренное пенообразование способствует росту многих аэробных микроорганизмов (пенный слой – кислородный коктейль). Особое внимание уделяется борьбе с избыточным пенообразованием, так как, если не препятствовать этому, пена смачивает фильтры для стерилизации воздуха, что приводит к контаминации культуры посторонней микрофлорой, уменьшению полезного объема биореактора, а также выходу пены наружу. Контроль пенообразования осуществляется путем введения в сосуд специального датчика. Для борьбы с избыточным пенообразованием используется механическое и химическое пеногашение. При механическом пеногашении лопасти пеногасителя размещаются на валу мешалки. При химическом пеногашении в крышке сосуда предусматривается специальный ввод для реагента гашения.

237 Химические пеногасители более дешевы, их используют время от времени при необходимости подавления пенообразования. Однако при добавлении этих веществ может изменяться состав питательной среды. Пеногасящие вещества растительного (кукурузное, касторовое, соевое, подсолнечное масло, масло из семян хлопчатника и другие) и животного (свиной, говяжий, бараний, китовый и другие жиры) происхождения могут служить микроорганизмам источником углерода и энергии и, следовательно, стимулировать их активное развитие. Однако известны случаи, когда природные пеногасители оказывали отрицательное действие на метаболизм клетки. А такие неметаболизируемые пеногасители, как силиконы, в высокой концентрации токсичны. Поэтому пеногасители, являющиеся поверхностно-активными веществами, следует использовать только в очень низких концентрациях и только после тщательной проверки. Пеногасители добавляют непосредственно в среду перед стерилизацией или в ферментер через специальный ввод.

238 Аппараты для анаэробных процессов достаточно просты и применяются в процессах конверсии растительного сырья, а также различных промышленных отходов. При метановом брожении для получения биогаза, а также в ряде других процессов (получение ацетона, шампанских вин) используют ферментационные аппараты (метанотенки). Эти аппараты имеют различную конструкцию (от простой выгребной ямы до сложных металлических конструкций или железобетонных сооружений) и объемы (от нескольких до сотен кубометров). Метанотенки оборудованы системой подачи сырья, системой теплообменных труб для стабилизации температуры, несложным перемешивающим устройством для гомогенного распределения сырья и биомассы продуцента, газовым колпаком и устройством переменного объема (газгольдер) для сбора образуемого биогаза.

239

240 КУЛЬТУРАЛЬНАЯ ПОСУДА Для культивирования клеток обычно используют флаконы, колбы, матрасы, чашки Петри, платы, роллерные сосуды, пробирки, пипетки и т. д.

241 Посуда из стекла В последние годы посуда из стекла не утратила своего значения, благодаря ряду бесспорных преимуществ: хорошие адгезионные свойства поверхности; многократность использования; биологическая инертность стекла ряда составов; термостойкость и другие. Кроме того, в экспериментах с контролируемым уровнем кислорода необходимо пользоваться именно стеклянной посудой, т. к. в пластике кислород может растворяться. Помимо этого из пластика могут экстрагироваться водорастворимые органические соединения.

242 Для стеклянной лабораторной посуды на практике в основном применяются два типа составов – многощелочное и малощелочное. Щелочесодержащие силикатные стекла имеют недостаточную термостойкость и химическую устойчивость к воде, кислотам и щелочам. Алюмоборосиликатные малощелочные стекла типа «Пирекс» характеризуются высокой устойчивостью к воде, устойчивостью к щелочным растворам и ко всем кислотам за исключением плавиковой (фтористоводородной) и горячей фосфорной. Кроме того стекла типа «Пирекс» обладают хорошими оптическими свойствами. Однако успех в эксперименте обеспечивается не только качеством стекла, но и степенью подготовки лабораторной посуды. Посуда для культивирования должна быть чистой физически, химически и биологически.

243 Пластиковая посуда Начиная с 1965 года, все большее применение в лабораторной практике находит пластиковая посуда одноразового использования. Такая посуда проста в использовании, т. к. выпускается в стерильном, готовом к работе виде. Стерилизация производится в процессе изготовления физическими (облучение УФ светом или гамма лучами) или химическими (газы – окись этилена, жидкости – этиловый спирт, раствор пергидроля) способами. Пластиковая посуда производится в двухх модификациях – для культивирования микроорганизмов и для культивирования клеток.