Составитель: к.б.н. Вечканов Е. М. кафедра биохимии и микробиологии ЮФУ. - презентация

1 Составитель: к.б.н. Вечканов Е. М. кафедра биохимии и микробиологии ЮФУ

2 Разделение веществ с помощью центрифугирования основано на разном поведении частиц в центробежном поле. Суспензию частиц, помещенную в пробирку, загружают в ротор, установленный на валу привода центрифуги. В центробежном поле частицы, имеющие разную плотность, форму или размеры, осаждаются с разной скоростью. Скорость седиментации зависит от центробежного ускорения (G), прямо пропорционального угловой скорости ротора (ω, в рад*с -1 ) и расстоянию между частицей и осью вращения (r, в см): G = ω 2 r Поскольку один оборот ротора составляет 2π радиан, угловую скорость ротора в оборотах в минуту можно записать так: ω = 2 π (об*мин -1 ) / 60 Центробежное ускорение тогда будет равно: ω = 4 π 2 (об*мин -1 ) 2 r / 3600

3 Центробежное ускорение обычно выражается в единицах g и называется относительное центробежное ускорение. ОЦУ = 4 π 2 (об*мин -1 ) 2 r / 3600 * 980 Скорость седиментации сферических частиц зависит не только от центробежного ускорения, но и от плотности и радиуса самих частиц и от вязкости среды суспендирования. Время, необходимое для осаждения сферической частицы в жидкой среде от мениска жид­кости до дна центрифужной пробирки, обратно пропорционально скорости седиментации и определяется следующим уравнением: t = 9/2 η / 2 ω 2 r 2 (p x – p) ln r д /r m

4 Для определения G соединяют прямой линией значения радиуса и скорости вращения ротора на крайних шкалах; точка пересечения этой прямой со средней шкалой дает искомую величину центробежного ускорения. Следует иметь в виду, что правая колонка цифр шкалы G соответствует правой колонке цифр шкалы скорости вращения ротора; левая левой.

5

6 Метод разделения субклеточных частиц, основанный на различиях их коэффициентов седиментации, которые приблизительно пропорциональны размеру. Клеточные экстракты последовательно центрифугируют с возрастающей скоростью. Большие частицы, такие как ядро и митохондрии, осаждаются при относительно низких скоростях; для осаждения мелких частиц, таких как рибосомы, требуются более мощные центробежные силы. Сначала частицы распределены по всему объему центрифужной пробирки равномерно (а); в ходе центрифугирования частицы седиментируют в соответствии с их размерами и формой (б д).

7

8 Особенности этого типа центрифугирования отражены в са­мом его названии: «скоростное» потому что частицы разделя­ются по скорости их оседания, причем плотность их значительно больше, чем плотность среды; «зональное» так как частицы различных размеров оседают более или менее тонкими слоями «зонами». Осадков не образуется. Центрифугирование ведут в багет-роторах. После того, как зоны достигнут оптимального распределения по длине пробирки, центрифугирование прекра­ щают, и зоны частиц описанным ниже способом извлекают одну за другой. Перед началом центрифугирования суспензию частиц наслаивают поверх градиента плотности жидкости (а). При скоростном центрифугировании частицы не достигают изопнкнической точки», а при изопикническом разделении центрифугирование продолжают до тех пор, пока исследуемые частицы не достигнут зоны с соответствующей плотностью (б).

9 Перед центрифугированием частицы распределены по объему центрифужной пробирки равномерно (а). После центрифугирования более легкие частицы всплывают наверх, в то время как тяжелые оседают на дно пробирки (б). Изопикническое центрифугирование проводят как в градиенте плотности, так и обычным путем. Если центрифугирование проводится не в градиенте плотности, препарат сначала центрифугируют так, чтобы осели частицы, молекулярный вес которых больше, чем у исследуемых частиц. Эти тяжелые частицы отбрасывают, и образец суспендируют в среде, плотность которой такая же, как и у фракции, которую хотят выделить.

10 Для того, чтобы зоны оставались узкими, необходимо проти­водействовать конвекции жидкости, в которой движутся части­цы. Эффективный способ подавления конвекции увеличение плотности этой жидкости вдоль радиуса вращения в направлении от мениска ко дну пробирки. Например, можно заполнять пробирку багет-ротора водным раствором сахарозы, концентрация которой нарастает по направлению ко дну пробирки. А затем уже на этот «градиент сахарозы» (как его для краткости называ­ют) наслаивать препарат смесь подлежащих разделению частиц.

11

12 Для создания градиента плотности используют соли тяжелых металлов, например рубидия или цезия, а также растворы сахарозы. Образец, например, ДНК, смешивают с концентрированным раствором хлористого цезия. И растворенное вещество (ДНК), и растворитель сначала распределяются по всему объему равномерно. В ходе центрифугирования устанавливается равновесное распределение концентрации, а следовательно, и плотности CsCl, так как ионы цезия обладают большой массой. Под действием центробежного ускорения молекулы ДНК перераспределяются, собираясь в виде отдельной зоны в части пробирки с соответствующей им плотностью. Метод применяется главным образом в аналитическом центрифугировании и был использован Мезельсоном и Сталем для изучения механизма репликации ДНК Е. coli.

13 Ультрацентрифугирование - метод разделения и исследования высокомолекулярных соединений, вирусов и субклеточных частиц с помощью ультрацентрифуги. Идея Ультрацентрифугирование было предложено А. В. Думанским в 1913, однако разработка современной теории седиментационного анализа стала возможной только после того, как Т. Сведберг в 1926 сконструировал высокоскоростную ультрацентрифугу, обеспечивавшую ускорение 105 g лет тому назад скоростные ультрацентрифуги состав­ляли едва ли не главную часть приборного оснащения любой био­химической лаборатории. Сейчас, когда молекулярная биология перешла на работу с микроколичествами исходных материалов, эти дорогие и капризные машины заняли куда более скромное место в арсенале исследователей. Тем не менее, в некоторых слу­чаях, когда предполагается начать обширную программу изуче­ния какого-нибудь однородного биологического материала, имеет смысл воспользоваться возможностями ультрацентрифугирова­ния.

14 Этим термином принято называть центрифуги, позволяющие достигать скорости вращения своих роторов вплоть до 80 тысяч оборотов в минуту. На радиусе ротора в 6 см это создает в радиаль­ном направлении ускорение в 700 тысяч раз превышающее уско­рение земного притяжения (« g»). Вращение с такой скоростью невозможно осуществить в нор­мальной атмосфере из-за катастрофического разогрева ротора. Поэтому главным элементом конструкции ультрацентрифуги яв­ляется вакуумная камера, в которой вращается ротор. Используя последовательное подключение к камере диффузионного масляного и обычного форвакуумного насосов, в ней удается достигнуть разрежения в 10 в -3 мм ртутного столба.

15

16

17 Свойства полученного при фракционировании препарата субклеточных частиц можно отнести к свойствам самих частиц только в том случае, если препарат не содержит примесей. Следовательно, всегда необходимо оценивать чистоту получаемых препаратов. Эффективность гомогенизации и наличие в препарате примесей можно определить с помощью микроскопического исследования. Однако отсутствие видимых примесей еще не является достоверным доказательством чистоты препарата. Для количественной оценки чистоты полученный препарат подвергают химическому анализу, который позволяет установить содержание в нем белков или ДНК, определить его ферментативную активность, если возможно, и иммунологические свойства. Анализ распределения ферментов во фракционируемых тканях основан на двух общих принципах. Первый из них заключается в том, что все частицы данной субклеточной популяции содержат одинаковый набор ферментов. Второй предполагает, что каждый фермент локализован в каком-то определенном месте внутри клетки.

18

19

20 В литературе можно встретить величину, характери­зующую собственные качества частицы (ее размер и плотность) в процессе седиментации, исключив скорость вращения и поло­ жение частицы, относительно оси вращения. Характеристикой частиц дисперсной фазы или молекул растворённого полимера может служить константа седиментации отношение скорости седиментации к ускорению поля центробежных сил. За единицу измерения константы седиментации принят 1 сведберг = сек. Эта константа зависит от массы и формы частицы (макромолекулы) и для белков изменяется в пределах от 1 до 200 сведбергов. Скорость седиментации или установление седиментационного равновесия в ультрацентрифуге, константы седиментации, массы и размеры коллоидных частиц или макромолекул, а также полидисперсность анализируемой системы вычисляют на основе оптических измерений по изменению показателей преломления или светопропускания раствора или коллоидной системы.

21 1. Lehninger - David L. Nelson., Michael M. Cox. Principles of biochemistry Методы практической биохимии/ Б. Уильямс., К. Уилсон. М: МИР, 1978