Ферменты в клинической биохимии

I. Основные свойства и закономерности действия ферментов

Ферменты (энзимы) – специфические высокоэффективные биологические катализаторы, синтезируемые живыми клетками.

Субстраты – вещества, с которыми происходит химическое превращение под действием ферментов.

Е – фермент; S – субстрат; ES – комплекс «фермент-субстрат»; Р 1, Р 2 – продукты реакции; К 1, К 2, К 3 – константы равновесия. Схема ферментативной реакциии

Скорость реакциии (V) – скорость, с которой уменьшается концентрация субстрата или увеличивается концентрация продукта реакциии. Выражается скорость реакциии в мкмоль/мин.

А – нисходящая; Б – восходящая. Кинетическая кривая ферментативной реакциии V=tg

Факторы, влияющие на скорость ферментативной реакциии: концентрация субстрата; концентрация фермента; активатор и его концентрация; ингибитор и его концентрация; рН среды; температура среды; буфер и его концентрация.

Зависимость скорости ферментативной реакциии от концентрации субстрата. Vmax [S] K M + [S] V = Для ферментов, подчиняющихся уравнению Михаэлиса-Ментена Для аллостерических ферментов Лаг-период

Активност ь фермента численно равна скорости ферментативной реакциии в оптимальных условиях на начальном линейном участке кинетической кривой при насыщающей концентрации субстрата

Международная единица активности (U, МЕ, Е, Ед) это количество фермента, которое катализирует превращение 1 кмоля субстрата или получение 1 кмоля продукта в минуту в стандартных оптимальных условиях. Единица активности в системе СИ (катал) соответствует количеству фермента, которое катализирует превращение 1 моля субстрата в секунду. 1 кат.= 6 × 10 7 МЕ 1 МЕ = 16, 67 × кат.

Скорость ферментативной реакциии (V) прямо пропорциональна концентрации фермента [E].

Скорость ферментативной реакциии зависит от природы субстрата и с различными субстратами для одного и того же фермента может отличаться в несколько раз.

Зависимость скорости гидролиза ацетилхолина ацетилхолинэстеразой от рН инкубационной среды рН оптимум 8,0-8,7 рН оптимум пепсина – 1,5 рН оптимум щел. фосфатазы – 9-10

Скорость катализируемой ферментом реакциии, а значит и его активность, существенно зависит от условий инкубационной среды

Повышение температуры всего на 1 °С приводит к увеличению скорости ферментативной реакциии на 2,5-20%. Определение активности фермента следует проводить при фиксированной температуре 37 или 30 и 25 °С (допустимо колебание ± 0,1°С).

II.Методы определения активности ферментов

А – нисходящая; Б – восходящая. Кинетическая кривая ферментативной реакциии V=tg

Концентрацию продукта реакциии или субстрата можно определить следующими способами: 1. Прямое фотометрирование 2. Окрашивание продукта или субстрата красителями 3. Тест Варбурга

Спектр поглощения НАДН и НАД +

Способы измерения скорости ферментативной реакциии А/мин=(А– А хол )/t А/мин=(А 2 – А 1 )/t А/мин= А ср /t плато

Расчёт ферментативной активности 1. По калибратору 2. По калибровочной кривой 3. По коэффициенту экстинкции продукта или кофермента в восстановленной форме (НАДН или НАДФН)

РАСЧЕТ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ ПО ФОРМУЛЕ ЛАМБЕРТА-БЕРА Е – активность фермента, Е/л; А/мин– изменение оптической плотности реакциионной смеси за 1 мин, ед. опт. плотности/мин; V – объём реакциионной смеси, мл; – милли молярный коэффициент экстинкции, л/ммоль см; 1 – длина оптического пути, см; v – объём пробы (сыворотки), мл; 1000 – коэффициент пересчёта активности в мкмоль/мин. л; F – фактор, где F

Международное общество клинической химии (IFCC) Европейское общество клинической химии (ESCLS) Скандинавское общество клинической биохимии (SCE) Французское общество клинической биохимии (SFBC) Немецкое общество клинической биохимии (DGKS)

III.Ферментативные методы определения субстратов

Ферментативные методы выгодно отличаются от химических Высокой специфичностью (практически не дают интерференции), Высокой специфичностью (практически не дают интерференции), Низкой температурой реакциий (не выше 37 °С), Низкой температурой реакциий (не выше 37 °С), Водной инкубационной средой Водной инкубационной средой Во всех этих методах аналит участвует в ферментативных реакцииях в качестве субстрата

Методы определения субстратов А/мин=(А– А хол )/t А/мин=(А 2 – А 1 )/t А/мин= А ср /t плато

IV.Основные правила работы с ферментами

1. Нельзя сильно встряхивать растворы ферментов и допускать образование пены при их перемешивании.

2. При растворении лиофильно- высушенных реагентов, контрольных материалов и контрольных сывороток, содержащих ферменты, раствор фермента перед использованием необходимо выдержать при комнатной температуре некоторое время, указанное в инструкции, чтобы фермент пришел в конформационно активное состояние.

3. Необходимо четко следовать инструкции производителя набора реактивов, строго выдерживая время реакциии.

4. Перед началом ферментативной реакциии температуру рабочего реагента необходимо довести до температуры анализа, указанной в инструкции, и обеспечить её поддержание в течение всего времени анализа с точностью ± 0,1°С.

5. Нельзя изменять соотношение рабочий реагент/сыворотка. 6. Нельзя разбавлять рабочий реагент. 7. Если концентрация анолита превышает верхнюю границу линейности набора, пробу необходимо разбавить в соответствии с инструкцией

8. Фотометрирование следует про- водить в указанном в инструкции диапазоне длин волн. 9. Длина оптического пути кюветы должна соответствовать указанно в инструкции.

1 0. Следует тщательно мыть посуду, пипетки, наконечники и многократно ополаскивать их дистиллированной водой. Особенно тщательно следует отмывать перекись водорода Необходимо следить за качеством дистиллированной воды, которую используют в процессе анализа.

11. При отборе проб малых объемов обязательно следует пользоваться автоматическими микродозаторами. 12. Рекомендуется как можно быстрее отделять сыворотку от сгустка и стремиться проводить анализ в день взятия крови у пациента.

13. Следует также строго соблюдать условия хранения ферментативных наборов и их компонентов, указанные в инструкции, т.к. ферменты термолабильные катализаторы. 14. Регулярно проверять правильность и воспроизводимость результатов анализов по контрольным сывороткам

Спасибо за внимание!