BIOCHIMIA - studiază chimia vieţii 1833 – Anselme Payen – descoperă diastaza (amilaza) 1896 – Eduard Buchner – studiază fermentaţia alcoolică 1903 – Carl Neuberg – părintele biochimiei

1950 – James D. Watson, Francis Crick, Maurice Wilkins – structura ADN- ului 1962 premiul Nobel pentru Medicină 1958 – George Beadle, Edward Tatum – rolul genelor premiul Nobel pentru Fiziologie şi Medicină 1988 – Colin Pitchfork – analiza ADN în criminalistică

BIOCHIMIA 1. Structuri celulare implicate în procesele biochimice 2. Apa – rolul ei în procesele biochimice 3. Macro- şi microelementele cu implicaţii biochimice 4. Enzimele 5. Vitaminele 6. Metabolismul oxidativ 7. Metabolismul glucidic 8. Metabolismul proteic 9. Metabolismul lipidic 10. Acizi nucleici 11. Metabolismul hormonal

Structuri celulare implicate în procesele biochimice - celula – unitatea structurală şi de reproducere a organismelor vii

- membrană semipermeabilă - asigură schimburile cu exteriorul celulei - menţine pH-ul celular - menţine compoziţia constantă a mediului intern şi potenţialul electric Membrana celulară

Compoziţie - lipide – fosfolipide, colesterol, glicolipide - proteine – vehiculante – transportă aminoacizi, ioni, glucoză - canaliculare – canale hidrofile pentru molecule mici - receptoare – comunicarea între celule - enzimatice – au proprietăţi catalitice - semnalizatoare – markeri individuali

Reticulul endoplasmatic - sistem canalicular, anastomozat - membrană cu strat dublu lipidic - RE neted – conţine enzime implicate în sinteza glucidelor, fosfolipidelor, acizilor graşi - RE rugos – conţine pe suprafaţă ribozomii

Lizozomii - formaţiuni granulare sferice, 0,4-1 μm - conţin enzime: proteaze, nucleaze, fosfataze, glicozidaze, lipaze - enzime latente; pH 5 - săculeţe de sinucidere - lipsa congenitală a unor enzime lizozomale – acumularea substratului - boala von Gierke – deficit de glucozo-6-fosfatază acumulare de glicogen - boala Gaucher – deficit de glucocerebrozidază - boala Tay-Sachs – deficit de hexozaminidază A (β-N-acetil-hexozaminidază) - deficit de glucozo-6-fosfat-dehidrogenază susceptibilitate crescută a hematiilor faţă de oxidanţi

Peroxizomii - în cantitate mare în ficat - conţin enzime ce degradează aa şi AG - are loc sinteza de H 2 O 2 care este inactivat de catalază Ribozomii - liberi sau ataşaţi de RE - corpusculii lui Palade - sinteza polipeptidelor şi proteinelor

Mitocondriile - 2 membrane lipidice - membrana externă – enzime implicate în CATC, MAO - membrana internă – sisteme de transport - matricea – enzime pentru β-oxidarea AG, CATC - criste – oxizomi – enzimele lanţului respirator compuşi macroergici termocentralele celulelor

Aparatul Golgi - transformă compuşii sintetizaţi în organism - sortarea proteinelor - oficiu poştal celular

Nucleul - membrană lipoproteică dublă - conţine ADN, ARN, nucleotide, proteine (histone) - ADN ARN m proteine

Apa – rolul ei în procesele biochimice % din greutatea corporală - depinde de: - vârstă - sex - adipozitate - tipul ţesutului - forme – apa liberă - apa structurată - apa legată - distribuţie – intracelular 55% - K +, PO extracelular 45% - Na +, Cl -

Structură moleculară - tetraedru neregulat - între molecule există legături de hidrogen - este un dipol electric - disociază H 2 O H + + HO -

Rol în organism - structural – în structura celulei, ţesuturilor - biochimic – reactant, produs de reacţie - solvent - mediu transportor - lubrifiant - termoreglator

Sisteme tampon - menţin pH-ul constant - compoziţie - acid slab + bază conjugată - bază slabă + acid conjugat - ecuaţia Henderson-Hasselbach

Sisteme tampon - H 2 CO 3 / HCO Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 - preteină / proteinat - hemoglobină / hemoglobinat - pH normal = 7,4 - variaţii fiziologice – somn, vârstă Modificări pH 7,42 – alcaloză pH = 7 – stare comatoasă pH = 7,6-7,8 – comă pH = 6,8 – deces pH = 8 - deces

Macro- şi microelementele cu implicaţii biochimice şi fiziologice - macroelemente - microelemente Sodiu -142 mEq/L - distribuţia apei în organism şi reglarea presiunii osmotice - realizarea echilibrului ionic - transmiterea inpulsului nervos - contracţia muşchiului cardiac

Potasiu - 3,1- 5,1 mEq/L - funcţia neuronilor - contractilitatea musculară - respiraţia celulară - activitatea cardiacă Calciu - 4,5- 5,3 mEq/L - reduce excitabilitatea neuromusculară - reglează secreţia glandelor endocrine - coagularea sângelui - activează enzime - integritatea şi permeabilitatea membranei celulare

Fosfor - 0,78-1,51 mmoli/L - 75% - hidroxiapatita din oase - 25% - combinaţii organice – fosfolipide, nucleotide, acizi nucleici, compuşi macroergici Magneziu - 1,5- 2,5 mEq/L - activator enzimatic - menţine structura ADN, ARN, ribozomi

Fier - femei – 0,8-1,3 mg/L - bărbaţi – 0,9-1,5 mg/L - structura hemoglobinei, metaloproteinelor (mioglobină, citocromi) - grupări prostetice ale enzimelor - induce sau stimulează procesele oxidative Mangan - cofactor enzomatic – oxidoreductaze, transferaze, hidrolaze, liaze - structura SOD

Seleniu - structura deiodinazei, glutation-peroxidazei - protecţie faţă de speciile oxidante Sulf - structura tioaminoacizilor, proteinelor - structura enzimelor – citocrom c oxidaza - structura unor grupe funcţionale enzimatice – coenzima A

ENZIME - enzime sau fermenţi - proteine sintetizate în celule - catalizează reacţiile biochimice biocatalizatori - avantaje faţă de catalizatorii chimici - viteză mare de reacţie - condiţii blânde de reacţie – 37 o C, p. atm., pH - specificitate de reacţie - reglarea directă sau indirectă a activităţii - catalizează reacţii endoterme prin intermediul unor reacţii exoterme

ENZIME Structura enzimelor - proteine simple - heteroproteine – partea proteică – apoproteină (apoenzimă) – specificitate de substrat - partea neproteică – cofactor – acţiunea catalitică - organică (coenzimă), - anorganică (ioni metalici) - nucleoproteine

Structura enzimelor - primară - succesiune de aa - secundară – orientarea spaţială – leg. de H - terţiară – leg. disulfidice, ionice, de H, hidrofobe - cuaternară – complexe tridimensionale; leg. necov, hidrofobe Situsuri catalitice Reglarea activităţii enzimatice

ENZIME Denumirea enzimelor - I - substrat + -ază (urează, glucozidază) - II – natura procesului catalizat + -ază (oxidază, hidrolază, transferază) - III – Comisia de Enzimologie a Uniunii Internaţionale de Biochimie şi Biologie Moleculară (IUBMB) – substrat + reacţia + -ază (glucozo-6-fosfat-dehidrogenază) - cod EC xxxx

Denumirea enzimelor - EC – alcool dehidrogenaza EC 1. – oxido-reductază EC 1.1. – acţionează asupra compuşilor cu gr. CH-OH EC – NAD + sau NADP + este acceptorul de H EC – NAD + este acceptorul de H

Denumirea enzimelor - EC – nicotinamid-N-metil transferaza EC 2. – transferază EC 2.1. – transferă un grup de 1 at. de C EC – transferă un grup metil EC – donorul este metionina S-adenozil-L-metionina + nicotinamida S-adenozil-L-homocisteina + 1-metil-nicotinamida

Localizarea enzimelor - nespecifică – în toate ţesuturile - specifică – pepsina, tripsina, H. tiroidieni - la nivel celular – membrană – GGT - citoplasmă – glicoliză, sinteza de acizi graşi - nucleu – ADN-giraza, ADN-polimeraza - lizozomi – enzime degradative - ribozomi – sinteza de proteine - RE – sinteza de glicogen, glicoproteine, CYP mitocondrii – respiraţia celulară, fosforilarea oxidativă, MAO, fosfolipaza A 2 - aparatul Golgi – procesarea proteinelor

Proenzime - zimogeni - activare prin – hidroliză limitată a unui peptid terminal - îndepărtarea unui oligopeptid din interiorul moleculei - metode de activare - chimică – mediul acid – pepsinogen pepsină - autocatalitică – tripsinogen tripsină - catalitică -

Izoenzime - au aceleaşi proprietăţi enzimatice, dar structură primară uşor diferenţiată, proprietăţi cinetice şi electroforetice diferite - sunt specifice enzimelor cu structură cuaternară - evidenţiate în acelaşi organism - numerotate în funcţie de proprietăţile electroforetice – N - ex. – lactatdehidrogenaza – LDH LDH 5

- creatinkinaza (creatinfosfokinaza) – CPK, CK - M 2, MB, B 2

Sisteme multiemzimatice - asociaţii enzimatice în cadrul unei căi metabolice Ex. complexul piruvat-dehidrogenaza - piruvat dehidrogenaza - lipoilreductaz-transacetilaza - lipoat dehidrogenaza

Clasificarea enzimelor - după sistemul IUBMB 1.Oxidoreductaze 2.Transferaze 3.Hidrolaze 4.Liaze 5.Izomeraze 6.Ligaze

1. Oxido-reductaze ox 1 + red 2 red 1 + ox Dehidrogenaze - H de la grupe funcţionale ( -CH 2 -OH, -CHO, -CH 2 -NH 2 ), nucleotide (NADH, NADPH) la substrat în absenţa oxigenului - oxidare anaerobă AH 2 + B A + BH 2 CH 3 -CH 2 -OH + NAD + CH 3 -CHO + NADH + H + ADH

1. 2. Oxidaze - H de la substrat la oxigen H 2 O sau H 2 O 2 - oxidare aerobă AH 2 + ½ O 2 A + H 2 O AH 2 + O 2 A + H 2 O 2

1. 3. Oxigenaze - introduc atomi de oxigen în moleculă Monooxigenaze (hidroxilaze) AH + O 2 + BH 2 A-OH + B + H 2 O - CYP CYP450 (hemoproteină) – substratul şi O 2 - NADPH-CYP450 reductaza - fosfatidilcolina RH + O 2 + 2H + + 2e – ROH + H 2 O

Dioxigenaze A + O 2 AO 2

1. 4. Hidroperoxidaze - catalaza H 2 O 2 + H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 H 2 O 2 + AH 2 2 H 2 O + A - superoxid dismutaza (SOD)

2. Transferaze A + BC AB + C Aminotransferaze acid aspartic + acid α-cetoglutaric oxal-acetat + acid glutamic TGO (AST, ASAT) acid glutamic + acid piruvic acid α-cetoglutaric + α-alanina TGP (ALT, ALAT)

2. 2. Kinaze α-glucoza + ATP glucozo-6-fosfat + ADP hexozil transferaza Glicoziltransferaze glu-UDP + -(glu) n- 1- glicogen + UDP hexokinaze I, II, III, IV

2. 4. Metiltransferaze S-adenozil-metionina + dopamina 3-metoxi-tiramina + S-adenozil-homocisteina COMT serina + acid tetrahidrofolic glicina + metilen tetrahidrofolat serin-hidroximetil transferaza

3. Hidrolaze AB + H 2 O A-OH + BH -fosfataze, proteaze, fosfolipaze, tiolaze, lipaze tripsina trigliceride + H 2 O glicerol + acizi graşi lipaza

4. Liaze - catalizează eliminarea din molecule CO 2, H 2 O, NH 3 acid glutamic GABA + CO 2 glutamat decarboxilaza Decarboxilaze Dehidraze acid citric acid cis-aconitic + H 2 O citrat dehidraza

5. Izomeraze - catalizează transformarea izomerilor optici sau structurali Epimeraze (racemaze) L-serina D-serina serin racemaza Mutaze glu-6-fosfat glu-1-fosfat fosfogluco mutaza

6. Ligaze (sintetaze) - C-C; C-N; C-S; C-O acid piruvic + H 2 CO 3 + ATP acid oxal-acetic + ADP + Pa + H 2 O piruvat carboxilaza acid acetic + CoA-SH + ATP Acetil-CoA + AMP + PP + H 2 O acil coenzima A sintaza

Centrul activ al enzimei E + S ES E + P Etape - recunoaşterea substratului, fixarea substratului - transformarea substratului - eliberarea produsului de reacţie - refacerea enzimei Centru activ (situs activ) – preformat, după activarea enzimei -COOH – acid glutamic, acid aspartic, lizină -OH – serină, tirozină -SH – cisteină -heterociclu – histidină - aminoacizi adiacenţi centrului catalitic

Centru activ (situs activ) – format din: - centrul de recunoaştere - centrul catalitic Ex. acetilcolinesteraza - centru de recunoaştere – centru anionic – COO - din acid aspartic - centru catalitic (esterazic) - OH din serină, rest histidină

Modelul Fischer (clasic) Modelul Koshland (centru activ indus)

Specificitatea enzimelor - de reacţie – enzima catalizează un singur tip de reacţie - lactat-dehidrogenaza, glucozo-6-fosfataza - excepţie – enzime piridoxalfosfat dependente (transaminare, decarboxilare, aldolizare)

- de substrat – enzima acţionează asupra unui substrat sau grupuri de substrate înrudite chimic - tipuri - absolută – anhidraza carbonică, ureaza, catalaza - relativă – alcool dehidrogenaza - largă – hidrolaze, proteaze (tripsina, pepsina)

- stereochimică – enzima transformă un singur tip de izomer sau determină formarea unui tip de izomer geometric sau optic - proteaze – pentru L-aa - maltaza – legături α-glicozidice - lactat dehidrogenaza – acid L-lactic în acid piruvic - enzime glucolitice – doar izomerii D ai glucozei - succinat dehidrogenaza – acid succinic în acid fumaric (nu acid maleic)

Cinetica enzimatică Energia de activare în reacţiile catalizate enzimatic - reacţiile enzimatice - exergonice - endergonice - substrat activat - energie liberă de activare – 1 mol substrat la temp. T, în stare de tranziţie (kcal/mol) - enzimele reduc energia de activare E

Creşterea vitezei reacţiei enzimatice - fixarea substratului optimă pentru atacul enzimatic - adaptarea indusă a structurii enzimatice - interacţiunea gr. NH 2 sau COOH din centrul catalitic cu substratul - fixarea covalentă a unei porţiuni de substrat

Viteza reacţiei enzimatice V = m substrat transformat în produs de reacţie / unitatea de timp Exprimarea vitezei de reacţie mol/s, mg/s, mol/min, mg/min Nr de turnover = nr. molec substrat transf de 1 moleculă de enzimă în 1 s UI = cantit de enzimă care transformă 1 μmol substrat, la 25 o C, pH optim Katal = cantit de enzimă care transformă 1 mol substrat în 1 s

Factori care influenţează activitatea enzimatică - mediu – temperatură, pH - substrat - concentraţia - enzimă – concentraţia - produşi de reacţie Influenţa temperaturii - pozitiv – modifică energia liberă de activare reduce durata reacţiei - temperatura optimă - negativ – afectarea structurii proteice a enzimei

Influenţa pH-ului - pH optim – acid (pepsina, enzime lizozomale), neutru, bazic (tripsina, chimotripsina) -modificarea pH-ului - modificarea gradului de ionizare a grupelor funcţionale - denaturarea structurii proteice - ionizarea substratului

Influenţa concentraţiei enzimei v = k · [E] v = [P] / t k · [E] = [P] / t [E] = [P] / k · t[E] ~ [P]

Influenţa concentraţiei substratului v 1 = k 1 · [E] · [S] v 2 = k 2 · [ES] v 0 = k 3 · [ES] v 1 = v 2 + v 0 k 1 · [E] · [S] = k 3 · [ES] + k 2 · [ES] k 1 · [E] · [S] = [ES] (k 2 + k 3 ) KMKM

[E] = [E T ] – [ES] K M · [ES] = [E T ] [S] – [ES] [S] K M · [ES] + [ES] [S] = [E T ] [S] v 0 = k 3 · [ES] ecuaţia Michaelis-Menten

[S] foarte mică faţă de K M [S] foarte mare faţă de K M v o ~ [S] v o ~ v max [S] = K M

Ecuaţia Lineweaver-Burk

Reacţii enzimatice cu mai multe substraturi - participă mai multe substraturi E + A + B E + C + D Mecanisme 1. tip ping-pong E + A EA E + C + B EB E + D

- ex. reacţiile de transaminare

2. tip secvenţial 2.a. ordonat E + A EA 2.b. aleatoriu + B EAB ECD - C E ED - D E + A EA E + B EB EAB ECD ED - C - D EC E E - D - C

Modificarea activităţii enzimatice - inducţie enzimatică - inhibiţie enzimatică Inhibiţia enzimatică - reversibilă – competitivă, necompetitivă, uncompetitivă - ireversibilă

1. Inhibiţia competitivă - substratul şi inhibitorul se fixează pe centrul activ E + S ES E + P E + I EI

- condiţii S şi I au afinitate pentru centrul activ ex. - competiţie PABA, sulfamide reacţii enzimatice cu 2 substraturi acid aspartic + acid α-cetoglutaric oxalacetat + acid glutamic TGO (AST, ASAT)

reacţii reversibile cofactorii metalici – Ca 2+, Mg 2+ R-O-PO 3 H 2 R-OH + H 3 PO 4 fosfataza alcalină

2. Inhibiţia necompetitivă - S şi I se fixează pe centri diferiţi E ESI +S ES E + P +I EI +S +I - ex. - ioni ai metalelor grele – gr. SH - chelatarea cationilor din centrul activ

3. Inhibiţia uncompetitivă E + S ESESI +I

4. Inhibiţia ireversibilă E + I EI - ex. - agenţi alchilanţi - compuşi organofosforici - agenţi anticoagulanţi - α 1 -antitripsina

Utilizarea inhibitorilor în medicină şi farmacie - medicamente - antivirale - aciclovir - antibiotice β-lactamice – peniciline, cefalosporine - anticanceroase - metotrexat - diuretice – inhibitoare ale anhidrazei carbonice - antiinflamatoare – COX 1 (AAS), COX 2 - antihipertensive – IEC (captopril) - antidepresive – IMAO (fenelzina) - antiglaucomatoase, miastenia gravă – anticolinesterazice - hipocolesterolemiante – I-HMG-CoA-reductaza (simvastatin) - antidot - alcool

Reglarea activităţii enzimatice Reglarea activităţii prin: - sinteza de proenzime - legare covalentă - enzime alosterice - enzime constitutive - enzime inductibile

Legare covalentă - activitatea enzimei este controlată prin fixarea sau îndepărtarea unor grupe de atomi - ex. - fosforilare – defosforilare - metilare – demetilare - acetilare – deacetilare - adenilare – deadenilare - proteoliză parţială – tripsinogen tripsină fosfataza + ATP - ADP + H 2 O -H 3 PO 4 kinaza E-OH E-O-PO 3 H 2

Enzime alosterice - interacţiune necovalentă cu liganzi în centri diferiţi de centrul activ - catalizează reacţii dintr-o cale metabolică - conţin 2 centri – activator, inhibitor - nu respectă ecuaţia Michaelis-Menten - interacţiunile cu liganzii - homotrope - heterotrope 2 tipuri – K – K M se modifică, v max constant - V - K M constant, v max se modifică

Modele structurale pentru interacţiunea enzimă-ligand a. simetric (concertat) (MWC)

b. secvenţial

Aplicaţiile enzimelor în medicină şi farmacie 1. Reactivi analitici - dozarea medicamentelor - dozarea compuşilor endogeni: glucoza, uree, acid uric - dozarea unor compuşi exogeni – alcool - tehnica ELISA 2. Agenţi terapeutici - streptokinaza, urokinaza - reptilase (Bothrops atrox, Bothrops jararaca) - hialuronidaza - asparaginaza - enzime proteolitice – tripsina, chimotripsina

3. Indicatori paraclinici - AST, ALT - cresc în infecţii virale hepatice, ALT persistă mai mult - infarct miocardic – creşte AST - distrofie musculară – creşte AST - CPK (CK) - creşte – copii, afecţiuni musculare, hipertermia malignă - CK 2 şi CK 3 crescute - afecţiuni miocardice, transplant - CK 1 crescut - leziuni cerebrale, neurochirurgie - fosfataza alcalină - creşte - obstrucţia căilor biliare, afecţiuni ale oaselor

- amilaza – creşte în pancreatita acută, traumatisme abdominale, radiografie abdominală - lipaza - creşte în pancreatita acută - scade - steatoree - colinesteraza - scade în hepatită, ciroză, infecţii acute, infarct miocardic, intoxicaţii cu insecticide organofosforice - creşte în tumori cerebrale - deficit – apnee după suxametoniu - fosfataza acidă – creşte în cancerul de prostată

Coenzime - anorganice - ioni metalici - organice - nevitaminice - vitaminice 1. Coenzime anorganice - ioni metalici - stabilizează structura, în centrul catalitic - tipuri de enzime - metaloenzime - metalul este fixat pe proteină – SOD, anhidraza carbonică - metaloporfirine – citocromi - metaloflavine – xantinoxidaza (2Mo, 8Fe, 2FAD) - enzime activate de metale (amilaza salivară – Ca 2+ ; carboxilaze – Mn 2+, ureaza – Ni 2+ )

hem B hem A 2. Coenzime organice nevitaminice Hemul – A, C, M, L hem C - grupare prostetică – citocromi a, c; catalază, peroxidază - donori sau acceptori de e - Fe 2+ Fe 3+ -e - +e-+e-

- hem L - lactoperoxidază - hem M - mieloperoxidază

Coenzima Q (ubiquinona) - descoperită în surse - endogenă - sintetizată în organism din tirozină şi acetil-CoA - exogenă – alimente (macrou, hering, inimă de porc) ( 14-32%) - localizare - membrana mitocondrială, RE, peroxizomi, lizozomi

- absorbţie – ca şi vitaminele liposolubile - transportor de hidrogeni - acţiune antioxidantă – cancer, boli neurodegenerative, migrenă

Acidul lipoic - aciltransferaza, piruvat-dehidrogenaza

Tetrahidrobiopterina - fenilalanin-4-hidroxilaza - tratamentul fenilcetonuriei (Sapropterin)

S-adenozil-metionina - metiltransferaze - sinteza poliaminelor: spermina şi spermidina noradrenalină adrenalină

ATP - transfer de fosfat, pirofosfat, adenil

Vitamine - liposolubile – A, D, E, K - hidrosolubile – B 1, B 2, B 3 (niacina), B 5 (acid pantotenic), B 6, B 7 (biotina), B 9 (acid folic), B 12, C

Vitamina A - derivat poliizoprenic - lichid uleios, insolubilă în apă, solubilă în solvenţi organici - UV – fluorescenţă verzuie descoperită, sintetizată

- surse – retinilesteri, caroteni - ficat 6500 μg, morcov 835 μg, brocoli frunze 800 μg, unt 684 μg - ouă 140 μg, piersici 96 μg - Momordica cochinchinensis, uleiul de palmier

contraceptive +

- abs %

Efecte biologice - necesar zilnic – 1 mg retinol, 6 mg β-caroten (sex, vârstă, starea fiziol.) - retinol, acid retinoic – creşterea şi diferenţierea celulelor (RAR, RXR) - menţinerea integrităţii epiteliului - vedere - acid retinoic – acnee, psoriazis - retinilfosfat – tranferul resturilor glicozil

- anticanceros – reduc rata diviziunii celulare - antioxidant – prin beta-caroteni Deficit de vitamina A - cauze - aport insuficient - tulburări de absorbţie - tulburări de depozitare în ficat - creşterea eliminării renale - carenţa de proteine - expunerea la oxidanţi

Deficit de vitamina A – simptomatologie cazuri de orbire la copii - xerodermie - nictalopie - xeroftalmie - ulceraţii ale corneei - retinita pigmentară - spoturi Bitot - anemie - reducerea rezistenţei la infecţii, HIV

Hipervitaminoza A - niveluri plasmatice = 10 x necesarul zilnic - intoxicaţia acută – dureri abdominale, greţuri, vomă, cefalee, ameţeli, descuamarea pielii - intoxicaţia cronică – dureri osoase, articulare, căderea părului, uscăciune şi fisuri ale buzelor, anorexie, hipertensiune intracraniană benignă, hepatomegalie - exces de caroten – colorarea tegumentelor în galben - risc de malformaţii la derivaţii de sinteză