ВЫДЕЛЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЛАКТОФЕРРИНА ИЗ МОЛОКА ТРАНСГЕННЫХ КОЗ И АНАЛИЗ ЕГО НЕКОТОРЫХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ биологический факультет кафедра биохимии Выполнила: Аспирантка Малюшковой Е.В. Научный руководитель К.б.н., доцент Семак И.В.

РУП «Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по животноводству Белорусский государственный университет

1) разработать лабораторную методику выделения рекомбинантного человеческого лактоферрина из молока трансгенных животных, получить очищенный препарат лактоферрина 2) доказать идентичность основных физико- химических характеристик рекомбинантного человеческого лактоферрина и лактоферрина из женского молока

Пространственная структура человеческого лактоферрина Человеческий лактоферрин состоит из 691 аминокислотного остатка. Молекулярная масса составляет ~80 к Да. Полипептидная цепь белка может быть разделена на две гомологичные глобулярные доли, в которых совпадают 37% аминокислот: N-доля, включает N-конец полипептидной цепи (аминокислотные остатки 1 – 333) C-доля, включает C-конец (остатки 345 – 691) Доли соединены -спиральным участком из 11 аминокислот (остатки 333 – 344) Структура лактоферрина поддерживается 16 дисульфидными связями N-доляC-доля

Все лактоферрины являются гликопротеинами. Число и локализация сайтов гликозилирования среди лактоферринов различных животных сильно варьируют: лактоферрин мыши имеет 1 потенциальный сайт гликозилирования лактоферрин человека - 3 сайта лактоферрины коровы, овцы и козы – 5 сайтов

Биологические функции лактоферрина Антибактериальное действие Противовирусное действие Фунгицидное действие Участие в связывании и транспорте ионов железа Противовоспалительное действие Противоопухолевое действие Ферментативная активность лактоферрина ДНКазная РНКазная Фосфатазная АТФазная Амилазная Протеазная (сериновая протеаза)

НАЗВАНИЕ БАДПРОИЗВОДИТЕЛЬСТРАНА Life extension Lactoferrin Life extensionСША Lactoferrin 250 мгRadiance Новая Зеландия LactoferrinImmunol Австралия Lactoferrin-GXNRL pharma Япония Super-smart Lactoferrin Super-smart Люксембург TernimaxHankintatukku Oy Финляндия Lactoferrin Gold 1.8 "Vita-tech International, Inc." США Symbiotics Lactoferrin- Colostrum Plus Capsules SymbioticsСША БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ДОБАВКИ, СОДЕРЖАЩИЕ ЛАКТОФЕРРИН КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОГРАММА СОЮЗНОГО ГОСУДАРСТВА «Разработка технологий и организация опытного производства высокоэффективных и биологически безопасных лекарственных средств нового поколения и пищевых продуктов на основе лактоферрина человека, получаемого из молока животных-продуцентов» («Бел РосТрансген-2»)

Микроинъекция векторной молекулы ДНК со встроенным геном человеческого лактоферрина в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ КОЗ Имплантация яйцеклетки, содержащей чужеродный трансген, в фаллопиеву трубу «приемной» матери ложно беременной самки, покрытой стерильным самцом Первичные трансгенные самцы LAC-1 и LAC-2 Трансгенные самки - потомки LAC-1 и LAC-2 Молоко, содержащее рекомбинантный человеческий лактоферрин

Трансгенные самцы LAC-1 и LAC-2

Концентрация рекомбинантного человеческого лактоферрина в молоке трансгенных коз Трансгенные козы (n) Концентрация*, г/л min-maxсреднее 101,9-10,06,2 Молоко Концентрация лактоферрина, мг/мл Женское 2 Козье 0,02-0,2 Коровье 0,1 * - концентрация определена методом ИФА

Порошок лактоферрина Молочная сыворотка Ионообменная хроматография Лактоферрин Ультрафильтрация Диализ Холодная стерилизация Лиофильное высушивание Обезжиренн ое молоко СХЕМА ВЫДЕЛЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ЛАКТОФЕРРИНА

При использовании одностадийной катионообменной хроматографии чистота полученных препаратов лактоферринов составляет более 95%. Двухстадийная катионообменная хроматография обеспечивает чистоту препаратов лактоферринов более 99% и позволяет отделить рекомбинантный человеческий лактоферрин от природного козьего лактоферрина.

1 л молочной сыворотки (концентрация лактоферрина 2 мг/мл) 1,6 г лактоферрина с чистотой >95% ACTA FPLC system (Amersham-Pharmacia)

Зависимость между молекулярной массой и относительной подвижностью белка при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (в логарифмической системе координат). Молекулярные массы стандартов белков: 25, 30, 40, 50, 60, 70, 85, 100, 120, 150, 200 к Да. Лактоферрин Согласно данным электрофореза молекулярная масса рекомбинантного человеческого лактоферрина составляет Да

Дегликозилирование рекомбинантного человеческого лактоферрина Гликозилированный лактоферрин Рисунок. Электрофореграмма гликозилированного и дегликозилированного рекомбинантного человеческого лактоферрина из молока трансгенных коз. ДСН – электрофорез в 7,5 % полиакриламидном геле. 1- стандарты молекулярных масс (40, 50, 60, 70, 85,100, 120, 150, 200 к Да); 2 – гликозилированный рекомбинантный человеческий лактоферрин; 3 - рекомбинантный человеческий лактоферрин после обработки пептид-N- глюкозидазой F Дегликозилированный лактоферрин к Да

Холоформа лактоферрина (+ Fe 3+ ) Апоформа лактоферрина (- Fe 3+ ) ПОЛУЧЕНЫ И ИЗУЧЕНЫ РАЗЛИЧНЫЕ ФОРМЫ ЛАКТОФЕРРИНА

Рисунок. Спектрофотометрический анализ способности опоформы рекомбинантного человеческого лактоферрина (apo-rhLF) связывать железо. apo-rhLF holo-rhLF + Fe 3+

ЗАКЛЮЧЕНИЕ С помощью фракционного осаждения, ультрафильтрации и катионообменной хроматографии выделены лактоферрины различного происхождения: рекомбинантный человеческий лактоферрин из молока трансгенных коз, природный лактоферрин из козьего молока и лактоферрин из женского молока; Получены образцы железо ненасыщенных (опо-) и железо насыщенных (коло-) форм лактоферринов; С помощью пептидного картирования, дегликозилирования, иммунохимического анализа, дифференциальной сканирующей калориметрии, спектрофотометрии, ЭПР-спектроскопии, хроматографического и электрофоретического анализа установлена идентичность основных физико-химических характеристик рекомбинантного человеческого лактоферрина и нативного лактоферрина из женского молока; С помощью сканирующей спектрофотометрии и ЭПР-спектроскопии доказана способность рекомбинантного человеческого лактоферрина связывать Fe 3+.

Благодарю за внимание