Главный врач МЦ «Новомедицина» доктор медицинских наук, профессор САРВИЛИНА Ирина Владиславовна Нанотоксикология – новое направление для исследований III съезд токсикологов России Москва, 1-5 декабря 2008 года г. Ростов-на-Дону, 2008

Цель нанотоксикологии : исследование риска, связанного со взаимодействием наноматериалов с организмом человека и окружающей средой. НАНОТЕХНОЛОГИИ – совокупность приемов и методов, применяемых при изучении, проектировании, производстве и использовании наноструктур, устройств и систем, включающих целенаправленный контроль и модификацию формы, размера, взаимодействия и интеграции составляющих их наномасштабных элементов (около нм), для получения объектов с новыми химическими, физическими, биологическими свойствами. Задачи нанотоксикологии: исследование физических и химических свойств наночастиц; исследование движения, превращения и взаимодействия наночастиц в окружающей среде; идентификация и анализ наночастиц в окружающей среде; исследование влияния наночастиц на организм человека и экосистемы; исследование эффектов наночастиц в организме человека и окружающей среде. НАНО(ЭКО)ТОКСИКОЛОГИЯ – это наука, исследующая эффекты взаимодействия разработанных нанорешений и наноструктур с живыми организмами. НАНО(ЭКО)ТОКСИКОЛОГИЯ

Нанотехнологии для разработки инновационных лекарственных средств Продукт нанотехнологий Вид продуктаПотенциальное значение Кантилевер Высокопроизводительный скрининг Идентификация белковых биомаркеров болезни Идентификация SNP Исследование генетической экспрессии Углеродные нанотрубки Идентификация мутаций в ДНК Идентификация белковых биомаркеров болезни Применение для целей лечения вирусных заболеваний и опухолевой патологии в комбинации с наночастицами. Дендримеры Секвестрирование цели Формы контролируемого высвобождения лекарств Разработка контрастирующих средств Нанопроводники Высокопроизводительный скрининг Идентификация биомаркеров заболеваний Идентификация SNP Исследование генетической экспрессии Наночастицы Мультифункциональные лекарства Целевая разработка лекарств

Биокинетика наночастиц в организме человека Подтвержденный путь Потенциальный путь Воздух, вода, одежда Разработка лекарств Воздух Пища, вода Кожа ЦНС ПНС Респираторный тракт NTBA ЖКТ Кровь (тромбоциты, эндотелиоциты, моноциты) Лимфа Печень Лимфа Костная ткань Другие ткани (мышцы, плацента) Почки Селезенка Сердце моча экскре менты грудное молоко эпидермис, потовые железы Воздействие Пути поступления Всасывание и распределение Пути выведения нейроны ИнъекцияИнгаляция Всасывание Нанесение

Размер частиц ТипРезультатыИсточник ~10 нмPEG квантовые точкиБыстрое появление квантовых частиц в печени, селезенке, лимфоузлах, костях Ballou et al

Механизмы токсичности наночастиц (Donaldson and Tran, 2002)

Биомоделирование в исследовании токсических эффектов наночастиц Удовлетворительная схожесть с организмом человека Стандартные модели (крысы, мыши, собаки и т.д.) Преимущества - Низкая стоимость и широкий диапазон биомоделей Возможность проведения доклинических испытаний на ранней стадии Скрининг молекул, формирующих молекулярный паттерн токсических эффектов наночастиц Высокая стоимость и узкий диапазон Поздняя стадия доклинических испытаний Низкая схожесть с организмом человека, но высокие предиктивные возможности Недостатки Новые биомодели (zebrafish )

Методы биотестирования на ранних этапах разработки наночастиц Низкая доза Высокая доза День 1, 3, 14 День -3/-4/, ½, ¾, 12/13 Анализ мочи Гематология Клиническая биохимия Изотонический раствор NaCl Гистопатология 2DPAGE/2DIGE/Идентификация белка ЯМР Метаболом Масс-спектрометрия доклиническое тестирование тестирование

Технологическая платформа для лаборатории нанотоксикологии 1. Оценка фармакодинамического эффекта лекарственного средства (спецметоды для каждого заболевания) и регистрация побочных эффектов (программа «Регистрация побочных эффектов на лекарственные препараты», разработка лаборатории информации и стандартизации в области лекарственных технологий ЮНЦ РАН,2005 г.) 2. Терапевтический лекарственный мониторинг на основе D- оптимальной стратегии и стратегии «пик-спад», экстракции лекарства из биоматериала и хромато-масс- спектрометрического исследования концентрации лекарственного средства в крови пациента 3. Идентификация значений параметров (Kabs, Kel, Vd), построение фармакокинетической/фармакодинамической модели (программа USC*PACK, США) на основе оценки фармакодинамических эффектов 4. Персонализация терапии. для токсикогеномных, токсикопротеомных исследований 1. Получение биологического образца. 2. Подготовка биологического образца к исследованию. 3. Аналитический двумерный электрофорез (IEF- SDS-PAGE) 4. Трипсинолиз белка в геле. 5. Получение спектров MALDI-TOF и/или ВЭЖХ/МС/МС 6. Поиск и идентификации белка в базах данных. разработки фармакокинетической/ фармакодинамической модели лекарственного средства Паци- ент Информация об индивидуальном фармакодинамическом эффекте и регистрация побочных эффектов Врач- фармакол ог ФК/ФД - моделирование Расчет индивидуального режима дозирования Лаборатория ИК-Фурье-спектроскопии, оценка фармацевтической эквивалентности ЛС, in-vitro тест на растворимость ЛС Лаборатория фармакокинетики, ВЭЖХ/МС-анализ 1. Проведение in-vitro теста на растворимость лекарства 2. Оценка качества лекарства на основе ИК-спектрофотометрии. Оборудование: ИК-Фурье спектрофотометр Spectrum BX FT-IR, Perkin Elmer, США, Масс- спектрометр-МС LCQ Deca XP MAX, Thermo Finnigan, США, детектор Surveyor MSQ, ВЭЖХ SURVEYOR LC, Thermo Finnigan, США для биофармацевтических исследований Окончательныйотчет Математическая статистика статистика Подбор команды исследователей Программа исследования исследования Блок-схема исследований по биоэквивалентности

Направление скрининга биомолекул, отвечающих за развитие побочных реакций: субстраты клетки, участвующие в жизненном цикле клетки, клеточной дифференцировке, клеточной пролиферации, цитотоксичности, апоптозе, транспортных феноменах; сигнальные молекулы в клетке – кальций-зависимые сигнальные пути, вторичные мессенджеры, ионные каналы, мембранный потенциал; продукты генетической экспрессии, мРНК, иРНК, белки, белок- белковые взаимодействия; мембранные рецепторы: лиганды, активация и десенситизация рецепторов, транслокация и эндоцитоз, сигнальные молекулы от рецепторов; молекулы, участвующие в транслокации в клетке. >50,000 данных в цветном формате за 24 часа Высокопроизводительный скрининг биомолекул – участников механизмов токсичности наночастиц Более образцов за 24 часа Стандартизация пробоподготовки и хранение биообразцов

Быстрые технологии оценки токсичности наночастиц: микрофлюидные технологии

Методы тестирования токсических эффектов наночастиц Генотипирование и фенотипирование в исследованиях FDA (США) CYP2C % CYP2C9 4.3% CYP3A4/5 14.3% CYP1A2 7.1% PhaseII 11.4% Pgp 4.3% Receptors 7% Others 22.9% CYP 2D6 72.9% Методы тестирования активности и SNP ключевых ферментов 2. Анализ метаболитов лекарств методом ИФА 3. Молекулярный генетический анализ (выделение ДНК с последующими PCR/MS; RT-PCR). Исследование молекулярных профилей биообразца органа-мишени с помощью технологий токсикопротеомики (2DIGE, 2DPAGE/MS/MS) Технология LC/MS/MS 1. Исследование активности ферментов методами: радиохимического анализа методом ВЭЖХ/МС/МС

Токсикопротеомика: результаты исследования динамики молекулярного профиля нефроцитов на фоне введения наночастиц Точки белков с увеличившейся экспрессией Точки белков со сниженной экспрессией

Европейский Центр по изучению безопасности лекарств Генетические и физические карты Сравнительная геномика Метаболические патологические пути и клеточная регуляция Межмолекулярные взаимодействия Идентификация генов и их структура Геномные базы данных Генетическая экспрессия Структурная геномика Мутации Секвенсинг мотивов белков Секвенсинг ДНК Секвенсинг РНК Протеомные базы данных PredToxProject Системная токсикология и химические эффекты биосистем Фармацевтическая протеомика Трансгеномика Компьютерные базы данных сети INTERNET по токсикогеномике, токсикопротеомике, токсикометабономике

Информационно-диагностическая база по токсическим и побочным эффектам наночастиц первичнойсоздание базы данных первичной информации по токсическим и побочным эффектам наночастиц на основе спонтанных сообщений; динамического наблюдениясоздание базы данных динамического наблюдения за повторным проявлением токсических и побочных реакций наночастиц; создание базы данных по результатам лабораторного тестирования наночастиц с обнаруженными побочными реакциями (токсикологические лаборатории); создание баз данных побочных реакций наночастиц у пациентов с различной патологией в Федеральных Округах, интегрированных в единую Всероссийскую базу данных. интеграция Всероссийской базы данных в международные базы данных по токсическим и побочным эффектам наночастиц.

УЧАСТИЕ НАНОЧАСТИЦ В ОСНОВНЫХ ЭТАПАХ КРУГОВОРОТА ВЕЩЕСТВ В ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ Введение наночастиц для восстановления УФ-деградация Разрыв/ смещения Естественная среда и человек Естественная среда и человек Воздух Почва Почвенная флора и фауна Пищевая цепь Пищевая цепь Водоносный слой Сорбция: органическое вещество Выветривание/ пыль Биодеградация Вода Химическая деградация? Выщелачи- вание Бентосные организмы Пищевая цепь Осадок Фильтро погло тители

Наноматериалы и влияние их на окружающую среду Идентификация опасности Оценка воздействия Управление риском Характеристика риска Дозозависимые воздействия Ингаляционно, ЖКТ, трансдермально Биологический мониторинг (молекулярные маркеры) Побочные эффекты наночастиц Человек Биомодели Физико-химические параметры и эффекты Данные по дозозависимым эффектам Исследования in-vivo Исследования In vitro Экологический мониторинг Здоровье/социальные/ экономические/ политические последствия Регуляторные стандарты и нормативы воздействия Оценка риска Возможность экстраполяции данных биомоделирования Механистические данные Профилактика/ измерение воздействия/ биомедицинские разработки

Закон РФ «О лекарственных средствах» Нормативная база и предложения в области нанотехнологий в РФ (ГК Роснано). Письмо Департамента государственного контроля качества, эффективности, безопасности лекарственных средств и медицинской техники Минздрава России от 26 июля 2001г /91 «О неблагоприятных побочных реакциях лекарственных средств». Правила клинической практики в Российской Федерации Приказ МЗ и СР Российской Федерации от , 266. Правила лабораторной практики в Российской Федерации Приказ МЗ и СР Российской Федерации от Государственный реестр ЛС; Федеральное руководство для врачей по использованию ЛС Приказ 88 «Государственный информационный стандарт ЛС. Основные положения» ( г.) Приказ 181 «Система стандартизации в ЗО. Основные положения» ( г.) Хельсинкская Декларация Всемирной Медицинской Ассоциации: рекомендации для врачей по проведению биомедицинских исследований на людях. – Хельсинки , дополнения 1975, 1983, 1996, Этическая экспертиза биомедицинских исследований: практические рекомендации. Под ред. Ю.Б.Белоусова.-М.-Изд г. OECD Principles on Good Laboratory Practice.-Документы Организации за экономическую кооперацию и развитие г. Документация и методические разработки по биомоделированию (рекомендации Комитета МЗ РФ, РАМН о содержании и применении лабораторных животных, рекомендации NIH в США ). European chemicals regulation (REACH), декабрь 2006 (EC No. 1907/2006 and Directive 2006/121/EC ). National Toxicology Program (NTP) Нормативная база для успешной работы центров по регистрации токсических эффектов и побочных реакций на наночастицы

внедрение международных и национальных шкал оценки токсических эффектов и побочных реакций на нанотехнологическую продукцию; разработка клинически релевантных биомоделей, позволяющих оценить токсические и побочные эффекты наночастиц, и в совокупности с in-vitro- исследованиями, in silico технологиями экстраполировать полученные результаты в клинику; внедрение и разработка нового оборудования, методов и технологий для оценки токсичности наночастиц в отношении органов-мишеней (токсикогеномики, токсикопротеомики, токсикометабономики); Безопасность нанотехнологий: дорога в будущее Необходимые меры: развитие компьютерных методов предиктивной токсикологии (позволяют снизить до 50% затрат на побочные реакции наночастиц) и создания информационно- диагностической системы по регистрации токсических и побочных реакций на наночастицы. формирование новой государственной и образовательной стратегии в области нано(эко)токсикологии.

I. НАУЧНЫЙ ЭТАП Наработка лабораторных образцов Разработка методов пробоподготовки Разработка условий анализа проб на оборудовании Уточнение и оптимизация схемы лабораторных работ Предварительная оценка показателей качества исследований II. ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ЭТАП Создание лабораторного регламента проведения исследований по молекулярной токсикологии Разработка документации для лаборатории, протоколов КХА Разработка математических методов анализа ФК/ФД данных III. ЛИЦЕНЗИРОВАНИЕ Код работ и услуг лабораторная диагностика (Приказ Минздрава России от «Об организации лицензирования медицинской деятельности») лабораторная генетика клиническая фармакология общественное здоровье и организация здравоохранения IV. АККРЕДИТАЦИЯ в системе аккредитации аналитических лабораторий ГОСТ Р, ИСО/МЭК «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий»; «Положение об аккредитованной лаборатории» Руководство по качеству Паспорт аккредитованной лаборатории Протокол КХА Этапы организации лаборатории токсикологии

С безопасными нанотехнологиями – к персонализированной медицине Генетические биомаркеры Протеомные биомаркеры Соединение с наночастицами Визуализация молекулярных событий Здраво- охранение Персонализированная медицина

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!