Что такое секвенирование? Секвенирование (sequencing) – это общее название методов, которые позволяют установить последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК. В настоящее время нет ни одного метода секвенирования, который бы работал для молекулы ДНК целиком; все они устроены так: сначала готовится большое число небольших участков ДНК (клонируется молекула ДНК многократно и «разрезается» её в случайных местах), а потом читается каждый участок по отдельности. Секвенирование (sequencing) – это общее название методов, которые позволяют установить последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК. В настоящее время нет ни одного метода секвенирования, который бы работал для молекулы ДНК целиком; все они устроены так: сначала готовится большое число небольших участков ДНК (клонируется молекула ДНК многократно и «разрезается» её в случайных местах), а потом читается каждый участок по отдельности.

А это уже история… К концу 60-х годов Ф.Сэнгером были разработан метод секвенирования РНК, получаемой с ДНК- матрицы при помощи РНК-полимеразы. К концу 60-х годов Ф.Сэнгером были разработан метод секвенирования РНК, получаемой с ДНК- матрицы при помощи РНК-полимеразы. В 1976 г. А. Максамом и У. Гилбертом был разработан метод секвенирования, основанный на специфической химической деградации фрагмента ДНК, радиоактивно меченного с одного конца. В 1976 г. А. Максамом и У. Гилбертом был разработан метод секвенирования, основанный на специфической химической деградации фрагмента ДНК, радиоактивно меченного с одного конца.

Секвенирование ДНК по Максаму – Гилберту ( ) Пусть есть образец ДНК, надо узнать его последовательность. Пусть есть образец ДНК, надо узнать его последовательность. Возьмем раствор, содержащий наш образец (одноцепочечную ДНК в достаточном количестве), дезоксинуклеотиды dNTP (кирпичи, из которых строится ДНК), ДНК-полимеразу (белок-строитель), и праймер к образцу (праймер – это комплементарная «затравка» - кусочек ДНК, комплементарный началу нашего фрагмента, достаточной длины, чтобы с него начался синтез комплементарной цепи): Возьмем раствор, содержащий наш образец (одноцепочечную ДНК в достаточном количестве), дезоксинуклеотиды dNTP (кирпичи, из которых строится ДНК), ДНК-полимеразу (белок-строитель), и праймер к образцу (праймер – это комплементарная «затравка» - кусочек ДНК, комплементарный началу нашего фрагмента, достаточной длины, чтобы с него начался синтез комплементарной цепи): Если позволить полимеразе работать (то есть, держать температуру, в которой ей удобно вести синтез), то в результате мы получим полностью достроенные комплементарные цепи. Если позволить полимеразе работать (то есть, держать температуру, в которой ей удобно вести синтез), то в результате мы получим полностью достроенные комплементарные цепи. 53

Секвенирование ДНК по Максаму - Гилберту А теперь разобьем всю смесь на 4 пробирки, в которых содержатся в небольшом количестве радиоактивно меченные ddATP, ddGTP, ddCTP или ddTTP (в каждой пробирке – что-то одно). А теперь разобьем всю смесь на 4 пробирки, в которых содержатся в небольшом количестве радиоактивно меченные ddATP, ddGTP, ddCTP или ddTTP (в каждой пробирке – что-то одно). У ddNTP нет кислорода на 3-конце, поэтому, если его встроили в молекулу ДНК, такая молекула удлиняться не будет, поскольку к ddNTP ничего присоединиться уже не может – на 3 кислорода нет. У ddNTP нет кислорода на 3-конце, поэтому, если его встроили в молекулу ДНК, такая молекула удлиняться не будет, поскольку к ddNTP ничего присоединиться уже не может – на 3 кислорода нет. dATP ddATP

Секвенирование ДНК по Максаму - Гилберту Позволим полимеразе работать в каждой из смесей. Для каждой молекулы образца она будет достраивать комплементарную цепь, пока не встроит ddNTP. Притом в пробирке с ddATP это может случиться только в тех местах, где в образце содержался тимин (комплементарный аденину ddATP). Тогда, если в образце были тимины в положениях 5, 7, 14, 15, то в пробирке с ddATP мы получим фрагменты ДНК комплементарной цепи с такими длинами. Позволим полимеразе работать в каждой из смесей. Для каждой молекулы образца она будет достраивать комплементарную цепь, пока не встроит ddNTP. Притом в пробирке с ddATP это может случиться только в тех местах, где в образце содержался тимин (комплементарный аденину ddATP). Тогда, если в образце были тимины в положениях 5, 7, 14, 15, то в пробирке с ddATP мы получим фрагменты ДНК комплементарной цепи с такими длинами. Сделаем форез, чтобы различить фрагменты разной длины в каждой пробирке, каждая дорожка фореза – одна пробирка. Сделаем форез, чтобы различить фрагменты разной длины в каждой пробирке, каждая дорожка фореза – одна пробирка. Поскольку ddNTP был радиоактивно помечен, то, проявив гель на фотопленке, мы увидим только комплементарные цепи с ddNTP. Поскольку ddNTP был радиоактивно помечен, то, проявив гель на фотопленке, мы увидим только комплементарные цепи с ddNTP.

ATGCAGAACAGACGATCAGCGACACTTTA (образец) AT ATGCAGAACAGACGAT ATGCAGAACAGACGATCAGCGACACT ATGCAGAACAGACGATCAGCGACACTT ATGCAGAACAGACGATCAGCGACACTTT

Применение в медицине: Микробиология: Микробиология: 1) Выявление патогенов: холера – на Гавайях, токсичная E.coli в Германии. 2) Анализ симбиотических организмов: микробом. Болезнь профиль экспрессии: Болезнь профиль экспрессии: Классификация опухолей, тонкий и/или ранний диагноз. Классификация опухолей, тонкий и/или ранний диагноз. Спектр мутагенеза – причина опухоли образования. Спектр мутагенеза – причина опухоли образования.

Спасибо за внимание !!!