ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ - презентация

1 П ОЛИМЕРАЗНАЯ Ц ЕПНАЯ Р ЕАКЦИЯ Выполнил: студент 265 группы стоматологического факультета Курятников Кирилл Николаевич Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Омский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

2 СУТЬ МЕТОДА Сущность ПЦР как метода молекулярной биологии заключается в многократном избирательном копировании (амплификации) определённого гена (участка ДНК) при помощи специальных ферментов в условиях in vitro. Важной особенностью ПЦР является получение копий конкретного участка ДНК (гена), соответствующего заданным условиям. В процессе полимеразной цепной реакции амплифицируются короткие участки ДНК (максимум пар нуклеотидов).

3 ПРИНЦИП МЕТОДА ПЦР Искусственно синтезируются строго специфичные фрагменты НК, исходя из предварительного поиска нуклеотидной последовательности искомой НК. Далее синтезируются два коротких ДНК- зонда или праймера, которые комплементарны соответствующим участкам НК-мишени. Праймер – самый главный элемент в ПЦР, обеспечивающий запуск и специфичность реакции. Таким образом, тест-система для ПЦР состоит из: смеси НК, испытуемого образца, праймера, дезоксирибонуклеотидов (набора нуктлеотидтри фосфатов) и термостабильной ДНК полимеразы (энзима термофильных бактерий Termus aquaticus)

4 ХОД ПЦР ПЦР включает три стадии: I. Денатурации. Происходит денатурация двухцепочечной молекулы ДНК (при нагревании реакционной смеси до 92-95°С двухцепочечной молекулы ДНК расплетаются и образуют две одноцепочечные молекулы). II. Гибридизации. Происходит отжиг праймеров с матричной ДНК (образование двухцепочечных «комплексов» праймер- матрица, необходимых для инициации синтеза ДНК). Гибридизация происходит по правилу Чаргаффа. Отжига праймеров не происходит если оно не соблюдено. III. Элонгации. Происходит удлинение комплементарных цепей в направлении от 5-конца к 3-концу цепи, начиная с участков присоединения праймеров, при помощи ДНК- полимеразы. При близких значениях температуры отжига праймеров и оптимума работы фермента, возможно, использовать двухстадийный цикл ПЦР, совместив отжиг и элонгацию в одной стадии.

5

6

7 Один цикл продолжается примерно 3 минуты. За 2 часа можно получить около миллиарда копий. После циклов экспоненциального нарастания реакции происходит выход на плато из-за истощения три фосфатов, праймеров и повреждений полимеразы. Поскольку праймеры физически включаются в концы ампликонов, этим самым детерминируется продукт ПЦР – фрагмент НК. ДНК-полимераза обладает способностью выбраковывать (редактировать) ошибочные не комплементарные нуклеотиды. Этим достигается высокая специфичность результатов исследования. Продукты ПЦР, или ампликоны, представляющие собой участок синтетической НК, ограниченный праймерами, на конечной стадии ПЦР идентифицируются методом электрофореза в геле.

8 Преимущества метода ПЦР диагностики как метода диагностики инфекционных заболеваний Прямое определение наличия возбудителей Высокая специфичность Высокая чувствительность Универсальность процедуры выявления различных возбудителей Высокая скорость получения результата анализа Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций