СРС Тема: Молекулярно-биологические методы: гибридизация НК, ПЦР, секвенирование ДНК. Прикладная иммунология. Выполнила:Кыстаубаева Ж.А. 219 группа ОМФ Проверила: Юланова Т.С. Государственный медицинский университет г. Семей Кафедра молекулярной биологии и микробиологии г. Семей 2015 год

План: I.Ведение II.Основная часть III.Заключение IV.Литература 1)Гибридизация НК 2)ПЦР 3)Секвенирование

Введение С конца 1950-х и начале 1960-х, молекулярные биологи научились характеризуют, изолировать и манипулировать молекулярных компонентов клеток и организмов. Эти компоненты включают ДНК, хранилище генетической информации; РНК, близкой родственницей ДНК, функции которых варьируются от действующей в качестве временной рабочей копии ДНК фактическим структурных и ферментативных функций, а также функциональную и структурную часть поступательного аппарата, а также белков, основных структурных и ферментативных типа молекул в клетках.

Гибридизация НК Многие этапы анализа рекомбинантной ДНК основаны на комплементарности взаимодействия цепей нуклеиновых кислот - необходимом условии синтеза ДНК и РНК. Путем нагревания или обработки щелочью двухцепочечную ДНК разделяют на отдельные цепи (денатурированная ДНК). Денатурированную ДНК инкубируют в условиях, обеспечивающих гибридизацию нуклеиновых кислот, то есть повторное образование двухцепочечных молекул путем спаривания нуклеотидов комплементарных цепей. Эта реакция настолько специфична, что гибрид одноцепочечной молекулы ДНК с комплементарной цепью (РНК или ДНК) можно выявить, даже если кДНК составляет лишь одну десятитысячную часть от общего количества ДНК. Метод позволяет различить полностью и частично гомологичные последовательности.

6 Гибридизация НК Метод позволяет различить полностью и частично гомологичные последовательности. Специфичность гибридизации нуклеиновых кислот, часто в сочетании с фракционированием или амплификацией, позволяет выявить нужный ген среди десятков тысяч других или нуклеиновую кислоту возбудителя инфекции даже тогда, когда единственная ее копия приходится на несколько клеток человека. Для выявления гибридизационных зондов используют радиоактивную метку или нерадиоактивные методы.

Гибридизация НК Часто применяется гибридизация нуклеиновых кислот с аллель-специфическими зондами. Такой зонд представляет собой синтетический одноцепочечный олигонуклеотид, обычно длиной нуклеотидов. Синтезируют два зонда, различающиеся одним нуклеотидом. Один из них точно соответствует нормальной последовательности, а другой - мутантной; в последнем замещенный нуклеотид расположен в средней части зонда. Условия гибридизации подбирают таким образом, что олигонуклеотид связывается только с идеально комплементарной ему последовательностью. Аллель-специфические олигонуклеотиды зонды можно использовать в сочетании с блоттингом по Саузерну, но сейчас их чаще используют в сочетании с амплификацией ДНК.блоттингом по Саузерну

ПЦР это метод лабораторной диагностики, направленный на выявление возбудителей инфекционных заболеваний. Трехбуквенный вариант это аббревиатура названия «полимеразная цепная реакция». Метод ПЦР был разработан в 1983 году Кэри Мюллисом, за что он был удостоен Нобелевской премии.

ПЦР Основу метода составляет катализируемое ДНК-полимеразой многократное образование копий определённого участка ДНК. Первоначально проводят отжиг термическое разделение двухнитевой молекулы ДНК на отдельные цепочки. Затем среду охлаждают и вносят праймеры (затравки), комплементарные нуклеотидным последовательностям обеих цепочек. Для запуска реакции применяют синтетические праймеры олигонуклеотиды, состоящие из нуклеоти-дов (например, дезоксинуклеотидтрифосфат), взаимодействующие с окончаниями последовательностей и образующие последовательности в оснований. Затем в среду вносят термостабильную tag-полимеразу (по названию бактерии Thermits aquaticus), что запускает образование вторичных копий цепей ДНК, после чего образующиеся двухнитевые молекулы ДНК снова подогревают. Образующиеся отдельные цепочки остужают, вносят праимеры и снова повторяют процедуру подогрева и охлаждения; поскольку tag-полимераза термостабильна, то необходимость в её повторном внесении отсутствует (рис ). ПЦР позволяет получить большие количества изучаемого фрагмента ДНК даже в том случае, если в распоряжении исследователя имеется всего лишь одна исходная молекула геномной ДНК. Идентификацию копий ДНК проводят методом электрофореза. Метод полимеразной цепной реакции ( ПЦР ) лежит также в основе ДНК-идентификации личности, установления родства людей, выявления генов наследственных болезней и пр.

Секвенирование ДНК К концу 60-х годов Ф.Сэнгером были разработан метод секвенирования РНК, получаемой с ДНК- матрицы при помощи РНК-полимеразы.

Секвенирование ДНК по Сэнгеру: "плюс- минус" метод Первым методом прямого ферментативного секвенирования ДНК стал метод, предложенный Ф. Сэнгером и Д. Коулсоном в 1975 г. В качестве матрицы в реакции полимеразного копирования использовался одноцепочечный фрагмент ДНК, в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды или природные субфрагменты, получаемые при гидролизе рестрицирующими эндонуклеазами, а в качестве фермента - фрагмент Кленова ДНК полимеразы I (PolI) из E.coli. Метод включал два этапа. Сначала в ограниченных условиях проводили полимеразную реакцию в присутствии всех четырех типов dNTP (один из них был мечен по альфа-положению фосфата), получая на выходе набор продуктов неполного копирования матричного фрагмента. Смесь очищали от несвязавшихся дезоксинуклеозидтри фосфатов и делили на восемь частей. После чего в "плюс" системе проводили четыре реакции в присутствии каждого из четырех типов нуклеотидов, а в "минус" системе - в отсутствие каждого из них. В результате, в "минус" системе терминация происходила перед dNTP данного типа, а в "плюс" системе - после него. Полученные таким образом восемь образцов разделяли с помощью электрофореза, "считывали" сигнал и определяли последовательность исходной ДНК. Этим способом была секвенирование короткая ДНК фага фХ174, состоящая из 5386 нуклеотидных пар.

В 1977 г. автор "плюс-минус" метода предложил еще один способ ферментативного секвенирования, получивший название метода терминирующих аналогов три фосфатов. Более мощный и более технологичный, этот способ, несколько модифицированный, применяется до сих пор. В основе метода тоже лежало ферментативное копирование с помощью фрагмента Кленова ДНК полимеразы I из E.coli. В качестве праймеров использовали синтетические олигонуклеотиды. Специфическую терминацию синтеза обеспечивали добавлением в реакционную смесь помимо четырех типов dNTP (один из которых был радиоактивно мечен по альфа положению фосфата) еще и одного из 2',3'-дидезоксинуклеозидтри фосфатов (ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP), который способен включаться в растущую цепь ДНК, но не способен обеспечивать дальнейшее копирование из-за отсутствия 3'-ОН группы. Отношение концентраций dNTP/ddNTP авторы подбирали экспериментально, так, чтобы в итоге получить набор копий ДНК различной длины. Таким образом, для определения первичной структуры исследуемого фрагмента ДНК требовалось провести четыре реакции копирования: по одному типу терминаторов в каждой из реакций. После этого полученные продукты разгонялись в полиакриламидном геле на соседних дорожках и по расположению полос определялась последовательность нуклеотидов.

Частная иммунология Частная иммунология носит прикладной характер. Основные направления : I.Вакцинология II.Иммуноонкология III.Иммунопатология IV.Аллергология V.трансплантационная иммунология Частная иммунология носит прикладной характер. Основные направления : I.Вакцинология II.Иммуноонкология III.Иммунопатология IV.Аллергология V.трансплантационная иммунология

Частная иммунология Вакцинология изучает методы искусственного создания невосприимчивости к инфекционным агентам и принципы разработки новых вакцинных препаратов. Трансплантационная иммунология изучает иммунную несовместимость тканей, отторжение трансплантатов, условия и способы преодоления несовместимости. Иммуноонкология наука, изучающая роль иммунной системы в развитии злокачественных заболеваний. Иммунопатология и аллергология изучают нарушения иммунных реакций и механизмы развития извращённых реакций на Аг. Разработка новых методов иммунодиагностики заболеваний, создание средств и способов коррекции иммунных нарушений не менее актуальные направления современной иммунологии.

Заключение В настоящее время известно огромное количество всевозможных инфекционных заболеваний человека.Возбудители этих заболеваний настолько быстро эволюционируют и легко приспосабливаются к изменяющимся условиям среды,что диагностировать их становиться сложнее.Именно поэтому наряду с традиционными морфологическими,иммунологическими и биохимическими методиками применяются и молекулярно-биологические в диагностики для получения более точных результатов.

Использованная литература I. II. III. IV. V.