Лекция 4. Получение каллусной культуры и ее культивирование Вопросы 1. Получение каллуса и его культивирование 2. Физические факторы культивирования 3. Типы дифференцировки в культуре клеток

1. Получение каллуса и его культивирование Каллусные ткани являются одним из основных объектов при длительном культивировании in vitro. Каллус способствует заживлению ран и первоначально состоит из недифференцированных клеток, начало которым на раневой поверхности дают клетки тканей, способные к дифференциации (камбий, флоэма, молодые клетки ксилемы). Эта ткань защищает место ранения, накапливает питательные вещества для регенерации анатомических структур или утраченного органа. Для растения каллус представляет собой ткань, возникающую в исключительных обстоятельствах (обычно при травмах) и функционирующую непродолжительное время. 2

In vitro каллус образуется на изолированных кусочках ткани (эксплантатттттт). Образование и рост каллусной культуры регулируется ауксинами и цитокининами. Эти гормоны индуцируют образование каллуса у тех растений, которые его не образуют в ответ на ранение. 3

Каллусную ткань in vitro можно получить практически из любой живой ткани растения. 4 Выбор эксплантаттттт определяется целями исследования. Необходимо убедиться, что выбранный эксплант находится в подходящем биологическом состоянии.

Молодые ткани более пригодны для получения каллусной культуры, чем зрелые. Лучшими эксплантатттттми также являются ткани, ответственные за пролиферацию (разрастание ткани путём размножения клеток делением). Для индукции каллюсогенеза нежелательно использовать одревесневшие ткани, старые ткани с низким уровнем метаболизма, плохо пролиферирующие ткани (мякоть плодов и др.), ткани, покрытые восками, и т.п. 5

Проращивание простерилизованных семян в асептических условиях часто дает наиболее пригодный материал для получения каллусов. Процесс получения первичного каллуса и дальнейшего его культивирования требуют стерильности. Обычно используют известные методики стерилизации либо разрабатывают их экспериментально для каждого конкретного объекта. 6

Достаточно важным фактором для индукции каллюсогенеза является механическое повреждение ткани эксплантаттттт. Еще со времен Габерландта быстрое деление каллусных клеток связывалось с выделением растением в связи с травмой некрогормонов. 7

Известны примеры каллюсогенеза, не связанного с травмой. Так, образование каллуса в культуре изолированных пыльников, зародышевых мешков и некоторых других объектов происходит без наружного травмирования. 8

Многие ткани обладают физиологической полярностью, поэтому важна определенная ориентация эксплантов в пространстве при переносе их на питательную среду. - Кончики корней легко образуют каллус, если они помещены на агар горизонтально. - Сегменты стебля лучше образуют каллус, если их поместить вертикально, одним из концов погрузив в агар. 9

При этом каллус образуется более интенсивно на стороне эксплантаттттт, которая на материнском растении обращена к корню. В случае изоляции эксплантов из корнеплодов полярность не имеет существенного значения. 10

Для образования каллусной ткани in vitro клетки эксплантаттттт должны дифференцироваться, т.е. утратить специфические характеристики исходной ткани. Перестройка клеток эксплантов разных специализаций, предшествующая каллюсогенезу, происходит сходным образом. Клетки эксплантов теряют вещества запаса – липиды, крахмал, белки. Фотосинтезирующие клетки теряют хлорофилл и липиды хлоропластов. Разрушается аппарат Гольджи Перестаивается эндоплазматический ретикулум и элементы цитоскелета, увеличивается число полисом Клетка синтезирует РНК и ДНК, и начинается экспрессия генов, присущих каллусным клеткам Исчезают тканеспецифичные белки-антигены и появляются белки, специфичные для делящихся клеток Таким образом, превращению любой клетки в каллусную предшествует процесс глубокой биохимической и структурной перестройки. 11

Добавление к среде экзогенных гормонов приводит к началу каллюсогенеза. Обязательным условием дедифференцировки клетки и ее превращения в каллусную клетку является присутствие в питательной среде представителей двух групп регуляторов роста: ауксинов и цитокининов. (Наиболее удобной моделью для изучения механизма дифференциации и каллусообразования служит культура сердцевинной паренхимы стебля табака, поскольку для нее существует строгая зависимость индукции деления и каллусообразования от присутствия ауксина и цитокинина.) 12

Отсутствие цитокининов в питательной среде блокирует клеточный цикл в пресинтетическом периоде (сразу после выхода клетки из митоза). Поэтому, если в питательной среде присутствует только ауксин, клетки не делятся и после четырехдневной латентной фазы переходят к росту растяжением. Одни цитокинины без ауксинов приводят к такому же старению тканей, как и на среде без гормонов. 13

В результате процесса дедифференцировки происходит образование in vitro первичного каллуса. Но получить каллус первый раз из нового растительного материала часто бывает трудно, потому что ткани разных видов растений и даже разных частей растения требуют для дифференциации и каллюсогенеза разного количества и соотношения гормонов. 14

Сроки образования каллуса маклер сердцевидной на питательных средах Экспланты Варианты МС+vit В5+2,4-Д МС+vitC+ гидр. казеина + 2,4-Д + кинетин МC+vitB5+ vitC +2,4-Д +кинетин МС+vitC+2,4-Д +гидр. казеина +актив. уголь МС + 2,4-Д+ +кинетин Количество дней Листовые Роста нет Черешковые Роста нет

Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом на агаре, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющих строго определенной анатомической структуры. Однако было бы ошибочно думать, что каллусные ткани однообразны. Исследователи делят их на типы по таким морфологическим признакам, как цвет, консистенция, характер поверхности, а также по интенсивности роста и способности к озеленению. 16

Цвет каллусной ткани может быть беловатым, желтоватым, бурым, коричневым, полностью или частично пигментированным хлорофиллом или антоцианами. Темно-коричневая окраска часто возникает при старении каллусных клеток и связана с накоплением в них фенолов. Последние окисляются в хиноны. Для избавления от них в питательные среды вносят антиоксиданты. 17

18

В зависимости от источника получения различают гомогенные (содержат один тип клеток) и гетерогенные (содержат несколько типов клеток) каллусы. 19

В зависимости от консистенции каллусные ткани бывают рыхлыми, среднеплотными и плотными. Рыхлые каллусы состоят из сильно обводненных клеток и легко распадаются на мелкие агрегаты. Среднеплотные каллусы имеют хорошо выраженные очаги меристематической активности, их клетки могут быть отделены друг от друга сильным взбалтыванием. 20

Для плотных каллусов характерны очень мелкие клетки, а также наличие выраженных зон с камбиальными и трахеи подобными элементами. 21

В случае получения первичного каллуса при оптимально подобранной среде часть эксплантов обычно за 3–8 недель образует каллусы в количестве достаточном для пересадки. Для того, чтобы не произошло старения, утраты способности к делению и отмирания каллусных клеток, полученный каллус переносят на свежую питательную среду. Эту операцию называют пассированием. 22

Первичный каллус разделяют на части, которые в дальнейшем культивируются отдельно. Следует обратить внимание на размеры кусочков каллуса, переносимых на свежую питательную среду: если они слишком малы, то дальнейший рост каллуса может быть угнетен. 23

Каллусные ткани в условиях in vitro можно выращивать неопределенно долго, периодически пересаживая их на свежую питательную среду. Удачно полученные линии каллусных культур требуют регулярной пересадки примерно через каждые 4 недели. В зависимости от условий культивирования и происхождения исходного эксплантаттттт в каллусных культурах могут происходить различные преобразования. Одно из них заключается в образовании «привыкшей» ткани. Под действием факторов среды в процессе культивирования могут возникать мутантные клетки – продуценты больших количеств фитогормонов. 24

Если такие клетки получают преимущественное развитие, то в культуре обеспечивается уровень фитогормонов, необходимый для роста ткани на питательной среде без данного регулятора роста. В результате могут формироваться или ауксин- независимые или цитокинин-независимые культуры. Их принято называть «привыкшие» ткани или «химические» опухоли. 25

2. Физические факторы культивирования Для успешного культивирования изолированных клеток и тканей растений необходимо соблюдать определенные физические условия выращивания. Температурный фактор оказывает значительное влияние на рост в условиях in vitro, активность ферментов, часть из которых является необходимой для метаболизма источников питания и др. Температура в камерах фитотрона в большинстве лабораторий поддерживается на уровне 26, 1 о С, для культуры тканей тропических растений она может достигать 29–30 о С. В случае индукции морфогенеза температуру понижают до 18–20 о С. 26

Большинство каллусных тканей не нуждается в свете, так как они не имеют хлоропластов и питаются гетеротрофное. Исключение составляют некоторые зеленые каллусы. Большинство же каллусных тканей получают в темноте, или при рассеянном свете. Детерминированные к морфогенезу ткани переносят на свет и далее культивируют их при освещенности 1000–4000 лк. Культивирование изолированных меристем и их микроразмножение также происходит на свету. Кроме интенсивности освещенности на культуру ткани и ее физиологические особенности влияет качество света. Свет разной длины волны регулирует процессы первичного и вторичного метаболизма. Необходимо учитывать фотопериод, который требуется для данного культивируемого объекта. 27

Влажность в культуральной комнате должна составлять 60–70 %. Более сухой воздух способствует усыханию питательной среды в пробирках и колбах, если они закрыты ватными пробками, изменению ее концентрации и нарушению условий культивирования. 28

Наилучший световой и температурный режимы, а также режим оптимальной влажности можно создать с помощью климатических камер. При поверхностном и суспензионном выращивании клеточных популяций важное значение имеют условия аэрации и состав газов. Хотя оптимальные условия газового режима в культуре клеток и тканей остаются малоизученными, известно, что в зависимости от газовой смеси (кислород, азот, углекислота) резко изменяется как интенсивность клеточного деления, так и процессы дифференцировки и формообразования. 29

Вид световой комнаты 30

5. Типы дифференцировки в культуре клеток Дифференцировка клеток растений in vitro может происходить различными путями и в разной степени – от дифференцировки отдельных клеток до развития целого растения. Выделяют следующие ее типы: 1. Наиболее простой вид дифференцировки – появление в каллусной ткани дифференцированных клеток, имеющих специфическое морфологическое строение и выполняющих особые функции. Достаточно часто наблюдается возникновение эпибластов – клеток, депонирующих запасные вещества, а также вторичные метаболиты. 31

2. Гистологическая дифференцировка каллусных клеток (гистогенез) – образование в каллусе различных тканей. и клетки–спутницы флоэмы. В каллусной ткани может проходить образование млечников, волокон, трихом; сюда же можно отнести образование элементов сосудистой системы – трахеи и трахеиды ксилемы, ситовидные трубки 32

3. Органогенез – это дифференциация каллусных клеток в целые органы; превращение их в апексы стеблей или флоральные элементы. 4. Соматический эмбриогенез – образование в каллусной ткани или суспензионной культуре эмбриоидов, т.е. зачатков интактного растения, способных развиваться во взрослое растение. Ризогенез Развитие эмбриоидов 33

Морфогенез в культуре in vitro принято делить на два типа: 1. образование монополярных органов: апексы; вегетативные побеги; побеги, развивающиеся как флоральные элементы; кончики корней; 2. образование биполярных органов, развивающихся как соматические эмбриоиды. Соматический эмбриогенез – восстановление целого организма из его части 34

Кроме того, различают прямой и непрямой органогенез. Прямой органогенез – это путь, при котором развитие корней, стеблевых и цветочных почек происходит непосредственно из клеток эксплантаттттт без образования каллуса. Непрямой органогенез – путь формирования морфологических структур, приводящий к образованию корней, стеблевых и цветочных почек в каллусной культуре. 35

Возможные пути преобразования при культивировании изолированных растительных тканей и индукции морфогенеза 36

Направление процесса органогенеза in vitro зависит от следующих факторов: таксономической принадлежности и генотипа исходного растения; онтогенетического возраста растения; локализации ткани, использованной в качестве эксплантаттттт; действия физических факторов при культивировании (температура, содержание кислорода, продолжительность и качество освещения); длительности культивирования; состава питательной среды. 37

Зависимость от таксономической принадлежности наиболее хорошо прослеживается при сравнении особенностей культивирования изолированных органов и тканей у двудольных и однодольных растений. У двудольных растений каллусную ткань способную к органогенезу можно индуцировать не только из меристематических клеток, но из вполне дифференцированных тканей листьев, стебля, корня. У однодольных растений для получения каллусной ткани в качестве эксплантов используют только ткани, содержащие меристематические клетки. 38

Перечень семейств высших растений, расположенных по степени снижения способности к органогенезу 39

Такие различия в характере органогенеза при культивировании на средах одинакового состава определяются содержанием эндогенных фитогормонов в тканях исходного эксплантаттттт. Культивирование молодых листьев Образование корней Культивирование листьев растений средних по возрасту Образование стеблевых почек, корней Культивирование листьев зрелых растений Образование стеблевых почек Характер органогенеза 40

Уровень эндогенных фитогормонов определяет зависимость между типом органогенеза и локализацией ткани, используемой в качестве исходного эксплантаттттт. При культивировании на среде одного и того же состава сегментов стебля, выделенных из разных частей цветущего растения табака, можно наблюдать проявление разных типов органогенеза. 41

Сегменты стебля, изолированные от базальной части Образование вегетативных почек Сегменты стебля, изолированные от средней части Образование вегетативных и цветочных почек Сегменты стебля, изолированные из зон близких к соцветию Образование цветочных почек 42

Среди факторов питательной среды, влияющих на особенности регенерации в культуре ткани, наиболее важными для регуляции направления морфогенеза являются регуляторы роста. При наличии в среде разного соотношения этих гормонов наблюдаются следующие особенности 43

C точки зрения биотехнологии соматический эмбриогенез имеет много преимуществ перед органогенезом. Регенерант на основе соматического зародыша полностью сформирован, тогда как побеги, полученные в результате органогенеза надо укоренять, а лишний труд неэкономичен для биотехнологии. Соматический эмбриогенез незаменим и для фундаментальных исследований. Соматический эмбриогенез экспериментально вызванное развитие новых организмов из отдельных соматических клеток или из комплексов их. 44

Различают прямой и непрямой пути соматического эмбриогенеза. Прямой соматический эмбриогенез заключается в формировании вегетативного зародыша из одной или нескольких клеток тканей эксплантаттттт без стадии образования промежуточного каллуса. Непрямой соматический эмбриогенез заключается в формировании зародышей из клеток каллусной ткани или суспензионной культуры. 45

Процесс соматического эмбриогенеза можно разделить на две стадии: 1. Начальная клеточная фаза, которая менее других изучена и наиболее важна – это первичные процессы в проэмбриогенных клетках, связанные с их переходом в детерминированное состояние. Данный этап не характерен для зиготы, развивающейся из зародышевого мешка. 2. Переход к эмбриогенезу или развитию зародыша in vitro. Этот этап включает стадии, аналогичные стадиям при зиготическом эмбриогенезе: стадии глобулы, сердца, торпедо и сформированного проростка. 46

Морфологически такие стадии практически одинаковы in vivo и in vitro 47

Факторами, индуцирующими соматический эмбриогенез, являются фитогормоны. Наиболее эффективен ауксин 2,4-Д, однако он необходим только для детерминации клеток. Развивающиеся зародыши не нуждаются в гормонах, так как начинают вырабатывать их сами. Длительное пребывание проэмбрио ( предзародыш )в среде, содержащей ауксин, приводит к пролиферации клеток, составляющих эмбриональный комплекс, и к прекращению дифференциации эмбриоидов, то есть они снова превращаются в каллусные клетки. Эмбриогенный каллус, пересаженный на среду без ауксина или с пониженным его содержанием, образует эмбриоиды. Эмбриоиды, перенесенные на безгормональную среду, дают проростки. 48

Независимость соматического эмбриогенеза от гормонов является аргументом в пользу точки зрения о том, что сам процесс изолирования растительной клетки от организма стимулирует реализацию ее тотипотентности, т.е. переход к морфогенезу. ТОТИПОТЕ́НТНОСТЬ (от лат. totus весь, целый и potentia сила), способность отдельных клеток в процессе реализации заключенной в них генетической информации не только к дифференцировке, но и к развитию в целый организм. 49

50