«Вакцины от наркотиков – новое перспективное направление профилактики и лечения зависимости от ПАВ» Гамалея Н.Б., Берзина А.Г., Ульянова Л.И. ФГБУ ФМИЦПН им. В.П.Сербского Минздрава России

Злоупотребление психоактивными веществами (ПАВ), как легальными, так и запрещенными, остается серьезной медико-социальной проблемой во всем мире, несмотря на интенсивные попытки ее искоренения. В связи с тем, что частота рецидивов болезни достаточно высока, поиск новых подходов к лечению и первичной профилактике этого заболевания особенно актуален. Иммунопрофилактика наркоманий, или вакцинация от наркотической зависимости – это перспективное направление в наркологии, имеющее важное практическое значение, так как профилактика возможной в будущем наркотизации (первичная) или предупреждение дальнейших рецидивов (вторичная) является самым эффективным медицинским способом искоренения наркотической зависимости.

Активная иммунизация (вакцинация) обеспечивает продолжительную защиту с помощью специфических антител с участием механизма иммунологической памяти при минимальном согласии пациента на лечение. Может оказывать меньше побочных действий, чем общепринятые фармакотерапевтические методы, которые изменяют биохимию мозга. С экономических позиций, такой подход может быть наиболее эффективным.

Целью иммунофармакотерапии является использование высокоспецифических антител для связывания ПАВ в кровяном русле Образование комплекса антитело–ПАВ снижает проникновение ПАВ через гематоэнцефалический барьер, что приводит к уменьшению его подкрепляющего действия и предотвращает нежелательные эффекты на ЦНС.

Принцип иммунофармакотерапии. Нейтрализующие антитела связывают наркотик на периферии, препятствуя его проникновению в мозг через ГЭБ и снижая эффект подкрепления и др. нежелательные эффекты (Moreno, Janda, 2009).

Присутствие антител в кровяном русле способствует также возникновению градиента концентрации, позволяющего удалять ПАВ из мозга, поскольку психоактивные вещества могут свободно проходить через ГЭБ, а комплекс антитело-ПАВ - нет.

Успех иммунологического подхода во многом зависит от нескольких параметров: концентрации образующихся антител, их аффинности и специфичности по отношению к определенной молекулярной структуре. Иммунная система не может генерировать ответ на небольшие молекулы, имеющие молекулярный вес меньше 10 к Да. Молекулярный вес любого ПАВ (в т.ч. наркотиков) значительно ниже этой критической величины. Поэтому для запуска иммунного ответа низкомолекулярные соединения должны быть ковалентно присоединены к высокомолекулярному носителю. Обычно это достигается путем синтеза химически активного производного ПАВ, называемого гаптеном, включающего в себя связующую цепочку (спейсер) с реакционной группой на конце, которую используют для присоединения белка или др. вмс.

При активной иммунизации (вакцинации) соответствующий конъюгат ПАВ-белок может быть непосредственно введен в организм, что приведет к активации Т- и В- лимфоцитов и, в итоге, к выработке специфических антител. На этом принципе основаны разработанные за рубежом вакцины от кокаиновой и никотиновой зависимости, которые проходят масштабные клинические испытания.

Специфические вакцины от наркотиков Состояние вопроса (Orson F.M. et al., 2014; Priya N. et al., 2015) ВакцинаПАВ – Носитель Испытания у людей TA-CD TA-NIC NicVax NicQb- CYT002 (NIC002) Кокаин – холерный токсин b (Celtic Pharma) Никотин – холерный токсин b (Celtic Pharma) Никотин – экзопротеин А Pseudomonas aeruginosa ( Nabi Biopharmaceuticals) Никотин – вирусоподобная частица (Cytos Biotechnology and Novartis) Фаза I, Фаза IIа, Фаза IIб Фаза I, Фаза II, Фаза III Фаза I, Фаза II, Фаза IIб Вакцины против наркотиков, находящиеся на этапе клинических испытаний

Результаты клинических испытаний кокаиновой вакцины TA-CD Проведенные испытания выявили эффективность вакцинации по ряду показателей. Наибольший эффект отмечен у лиц с высоким уровнем антител к кокаину (>=43 мкг/мл). Однако доля таких пациентов составляла 38%, а эффект кокаиновой блокады длился 6-8 недель.

Перспективным считают сочетание вакцинации с генным переносом фермента, гидролизующего кокаин, а также с введением гуманизированных моноклональных антител к наркотику в виде пассивной иммунизации [Brimijoin S. et al., 2013]. Celtic Pharma планирует представить эту вакцину на рассмотрение FDA (Управление по контролю за продуктами и лекарствами в США).

Результаты клинических испытаний никотиновых вакцин Широкомасштабные испытания выявили ограниченную эффективность вакцин. Испытание NicVax включило 201 пациента и выявило в целом успешный результат в 11% случаев в сравнении с 6% в группе плацебо после 12-месячного катамнеза. Большинство лиц, бросивших курить, имели высокий титр антител. Испытание вакцины NicQb показало в целом сходные результаты. Клиническое испытание включило 159 человек, при этом успешный результат был отмечен в 29,5% случаев в сравнении с 21% в группе плацебо. И опять, наилучшие результаты были достигнуты у лиц с высоким уровнем антител (до 42% в группе).

При клиническом испытании вакцины TA-Nic людей иммунизировали четырьмя дозами вакцины в течение первых 8 недель (2 мес), затем проводили ревакцинацию на 32-й неделе (8 мес). Через 12 недель (3 мес) после начала испытаний всех участников убеждали бросить курить. Через 12 месяцев частота отказа от курения в группе лиц, получивших самую большую дозу вакцины, существенно превысила частоту в контрольной группе (38% против 8%). В настоящее время проводятся испытания фазы III (результаты еще не опубликованы).

Разработка в мире вакцин против морфина и героина находится на доклиническом этапе.

Морфин, героин Во многих развитых странах при опиатной зависимости применяются программы заместительной терапии, в частности, метадоновые, что снизило интерес к разработке вакцин от героиновой и морфиновой зависимости. Однако, в связи с тем, что в развивающихся странах злоупотребление опиатами возрастает, а это сопряжено с распространением ВИЧ и СПИДа, в последнее время интерес к таким вакцинам возродился.

В последние годы большую работу по синтезу различных конъюгатов морфина с белками (БСА, гемоцианин виноградной улитки, столбнячный анатоксин) провела группа исследователей из Мексики (Anton, Leff, 2006, 2009). Несколько иным образом были синтезированы конъюгаты морфина и героина с белком (гемоцианин виноградной улитки) другой группой исследователей (Stowe G.N. et al., 2011)

Изучение специфичности возникающих после вакцинации антител показало, что они хорошо взаимодействуют не только с соответствующими наркотическими веществами, но также и с их метаболитами, нейтрализуя их действие. Это очень важно, так как, в отличие от кокаина и никотина, метаболиты героина и морфина активны. Также важно, что образуемые при вакцинации этими антигенами антитела не обладают специфичностью по отношению к конкурентным антагонистам опиоидных рецепторов (налоксону и налтрексону).

Впервые возможность применения иммунотерапии опиатной зависимости с использованием антител к морфину была продемонстрирована в работе Bonese, Wainer и соавт., опубликованной в 1974 году. Это была пионерская работа. В ней авторы показали на экспериментальной модели обученной само введению героина макаки-резус, что активная иммунизация обезьяны конъюгированным антигеном морфин-БСА приводила к индукции гуморального иммунного ответа с образованием защитных антител. В результате образования таких антител само введение героина обезьяной прекращалось. И вот только 35 лет спустя, благодаря работам мексиканской группы ученых, эти работы получили продолжение.

Разработанная Anton и Leff (2009, 2011) вакцина, представляет собой смесь двух конъюгатов морфина со столбнячным анатоксином. Эта вакцина была предложена ими как кандидат для клинических испытаний на людях, поскольку в экспериментах на крысах она обеспечивала поддержание высокого уровня антител в течение 6-12 мес. и практически полностью прекращала само введение крысами героина.

Недостатки зарубежного подхода к разработке вакцин от наркотической зависимости Во всех разрабатываемых за рубежом вакцинах от наркотической зависимости антигенами, против которых в организме должны вырабатываться специфические антитела, являются конъюгаты, в которых молекулы наркотика связаны химическим путем с высокомолекулярным носителем. Хотя сами по себе такие конъюгаты не обладают наркогенным потенциалом, теоретически нельзя исключить их возможную диссоциацию в организме на составные компоненты.

Описанный подход зарубежных исследователей к разработке вакцин от наркотиков вступает в противоречие с действующим в РФ Федеральным законом 3–ФЗ «О наркотических средствах и психотропных веществах», запрещающим лечение наркомании наркотическими средствами. В связи с этим нам представляется более перспективным другой подход – использование для вакцинации не препарата наркотика, конъюгированного с высокомолекулярным носителем, а его «иммуноглобулиновой копии» - вторичных (антиидиотипических) антител.

Что такое антиидиотипические антитела и как их получить? 1. Когда мы иммунизируем животное конъюгатом ПАВ (в т.ч. наркотика) с высокомолекулярным носителем, в его организме начинают синтезироваться различные первичные антитела (Ат 1) – идиотипические. В частности, среди этих антител будут антитела, специфичные к молекуле ПАВ, в том числе к тем ее участкам, которые взаимодействуют с активным центром рецепторов. Такие участки Ат 1 можно назвать «рецепторным» идиотопами.

2. Если затем иммунизировать других животных такими первичными антителами к ПАВ, то в их организме начнется выработка различных видов вторичных антител (Ат 2), или антиидиотипических, которые могут специфически связываться с различными участками молекул первичных антител (Ат 1). Один из этих видов вторичных антител (Ат 2β) будет соединяться с «рецептоными» идиотопами, расположенными в участке связывания антител Ат 1 с гаптеном (ПАВ). Таким образом, эти вторичные антитела будут нести участки, имитирующие конфигурацию гаптена, являясь его «внутренним образом».

Связывание Ат 2b, направленных к рецепторному связывающему центру Ат 1 (идиотопу) ингибируется гаптеном (ПАВ). Присоединение Ат 2 к идиотопам, локализованным вне рецепторного связывающего центра, гаптен не ингибирует. Ат 1 Ат 2 Ат 2b

Антиидиотипические антитела (вакцины) разрабатывают для профилактики некоторых инфекционных заболеваний, когда для вакцинации нежелательно использовать нативные антигены (вирусы гепатитов человека, ВИЧ, возбудители менингита, хламидии), а также для лечения некоторых новообразований.

Антиидиотипические антитела могли бы быть применены в качестве антигенов вместо молекул наркотиков при создании вакцин от наркотической зависимости.

Антиидиотипические антитела к опиоидным рецепторам В 1984 и 1985 гг. появились работы Ng и Isom, в которых сообщалось о получении антиидиотипических антител, специфически узнающих опиатные рецепторы. По существу, эти антитела являлись «внутренним образом» опиатов, поскольку они угнетали связывание налоксона с гомогенатом мозга мышей. На модели изолированных vas deference мышей и продольной мышцы тонкой кишки морской свинки, сократительную способность которых стимулировали электрическими импульсами, было показано, что полученные антитела подавляли эти сокращения (подобно морфину).

С развитием техники получения моноклональных антител были получены моноклональные антиидиотипические антитела к опиоидным рецепторам (Gramsch et al., 1988). Первичными антителами в данном случае были антитела к бета-эндорфину. Антиидиотипические антитела в одинаковой степени вытесняли лиганды мю- и дельта-опиоидных рецепторов из связи с опиоидными рецепторами мембран мозга крысы, а также с рецепторами в растворе. В 1991 году Coscia et al. получили моноклональные антиидиотипические антитела к мю- и дельта-опиоидным рецепторам в ответ на иммунизацию антителами к морфину. В отношении мю-опиоидных рецепторов эти антитела проявляли агонистическую активность, которая блокировалась налоксоном.

Цель настоящего исследования: экспериментальная разработка вакцины на основе антиидиотипических антител к антигену морфин-белок для лечения зависимости от опиатов

Этапы исследования 1. Синтез конъюгатов химически активных производных морфина (гаптенов) с белками (бычий сывороточный альбумин, лизоцим). Известно, что предпочтительными участками для химической модификации молекулы морфина являются фенольный гидроксил при атоме углерода в положении 3 фенантренового кольца в молекуле морфина и спиртовый гидроксил при атоме углерода в положении 6 [Anton B.et al. 2009].

2. Получение первичных (идиотипических, Ат 1) поликлональных антител к конъюгатам морфина с БСА путем иммунизации кроликов смесью полученных антигенов. Для дальнейшей иммунизации из сывороток крови кроликов выделяли иммуноглобулины класса G (IgG). 3. Получение вторичных (антиидиотипических, Ат 2) поликлональных антител к антигену морфин-БСА путем иммунизации мини-свиней Светлогорской популяции кроличьими первичными антителами к антигену морфин-БСА. Для последующей вакцинации из сывороток крови свиней выделяли IgG.

4. Вакцинация крыс антиидиотипическими антителами (Ат 2) к антигену морфин- БСА для лечения зависимости от морфина и оценка ее эффективности. Этап 1. Получение зависимых от морфина крыс (оценка зависимости по тяжести опийного абстинентного синдрома, вызванного инъекцией налоксона, в сравнении с контрольной группой).

Оценка поведения животных в установке «Открытое поле» Изменение двигательной активности (значимое уменьшение горизонтальной и вертикальной активности). Появление специфических признаков опийного абстинентного синдрома.

Этап 2. Введение крысам вакцинного антигена с целью выработки в их организме третичных антител (Ат 3), способных связывать морфин в кровяном русле. Группы крыс (по 10 голов) 1 (опыт)234 (контроль) Ат 2 к антигену морфин- БСА свиньи IgG свиньи нормальный Полный адьювант Фрейнда, физиол. раствор Физиол. раствор 1 инъекция подкожно в 4 точки спины, 2 мг/кг IgG в ПАФ 2 инъекция через 14 дней внутрибрюшинно, 5 мг/кг IgG 3 инъекция через 7 дней внутрибрюшинно, 10 мг/кг IgG

Свободный выбор между раствором 2,5% сахарозы в воде и раствором морфина гидрохлорида в 2,5% растворе сахарозы для исследования предпочтения. Расчет коэффициента предпочтения препарата по формуле: Объем выпитого раствора препарата ________________________________ Общий объем выпитой жидкости Учет вели с 8 по 28 день от начала вакцинации и свободного выбора

Этап 3. Учет результатов влияния вакцинации на проявления зависимости от опиатов у крыс по изменению предпочтения раствора морфина в условиях свободного выбора в двухпоилочном тесте.

Изменение коэффициентов предпочтения (КП) крысами раствора морфина в условиях свободного выбора в динамике вакцинации (Δ%) Показатель Группы крыс 1234 Δ% изменения КП, (M ± m) –42 ± 4,59,2 ± 14,6 P<0,05* 15,8 ± 16,6 P<0,05* 7,3 ± 15,5 P<0,05* Отличие от группы 1 при множественных сравнениях по критериям Ньюмена-Кейлса и Даннета Сравнение средних КП за 2-ю и 4-ю недели

Выводы по этапу 3 Только в группе 1, получавшей инъекции вакцины, отмечено снижение коэффициента предпочтения раствора морфина в свободном выборе в среднем на 42% в отличие от всех других групп сравнения, где отмечено даже небольшое повышение предпочтения. Снижение предпочтения опиата в тесте свободного выбора является экспериментальным аналогом снижения влечения к наркотику у зависимых лиц и свидетельствует о достижении положительного эффекта лечения зависимости от опиатов данным вакцинным антигеном.

Этап 4. Учет результатов влияния вакцинации на проявления зависимости от опиатов у крыс по изменению поведенческой активности при синдроме отмены, вызванном введением налоксона.

Показатели двигательной активности крыс в установке «Открытое поле» (M ± m) после инъекций вакцины (на 7-й день после 3-ей вакцинации) Показатель Группы крыс (по 10 голов) 1 (опыт)234 Вертикальная акт-ть (сек) 229 ± 36 # 119 ± 24 * 101 ± 14 * 101 ± 17 * Неподвижность (сек) 119 ± 18 # 216 ± 29 * 227 ± 33 * 296 ± 37 * Суммарный балл абстиненции 15 ± 2,9 # 47 ± 11 * 65 ± 10 * 46 ± 9,4 * * P<0,05 (множественные сравнения с гр. 1, критерий Ньюмена-Кейлса) # Отсутствие значимого отличия от контр. гр. ненаркотизированных крыс

Выводы по этапам 3 и Крысы в группе 1,получавшие вакцинный антиген, проявляют менее выраженные признаки абстинентного синдрома после нахождения в течение 28 дней в условиях свободного выбора между растворами сахарозы и морфина в сахарозе, чем крысы групп сравнения 2, 3 и 4, что свидетельствует о меньшей выраженности у них зависимости от морфина.

2. У вакцинированных крыс в группе 1 зависимость от морфина была ниже вследствие снижения влечения к наркотику и потребления меньших количеств морфина в условиях свободного выбора.

Этап 5. Анализ сывороток крыс на присутствие антител к вакцинному антигену (Ат 2 к антигену М-БСА) и антител, способных связывать морфиновый гаптен, непрямым методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Титры антител (Ат 3) к вакцинному антигену – поликлональным антиидиотипическим (Ат 2) антителам свиньи к антигену М-БСА (М ± m) Показатель Группы крыс (по 10 голов) 1(опыт)234 Антиген для вакцинации Антиген для сорбции в ИФА Ат 2 к М-БСА М-лизоцим Норм. IgG свиньи Адъювант Фрейнда, Физ. р-р Средний геом. титр антител в ИФА(log2) 1 : 8446 (1:13,044± 0,340) P=0 (крит.М-У, t- крит. Ст.) 1 : 1600 (1:10,644± 0,365) --

Анализ антител (Ат 3), способных связывать морфиновый гаптен, в сыворотке крови крыс методом ИФА Средний геометрический титр антител к морфиновому гаптену в группе 1 (изначально морфинизированной и в дальнейшем вакцинированной) оказался равным 1 : В контрольных группах 2, 3, 4 такие антитела не обнаружены, что свидетельствует о возможности применения вакцинного антигена для выработки антител, связывающих опиаты в крови.

Вывод Проведенные исследования в экспериментах на грызунах показали эффективность вакцинации антиидиотипическими антителами к антигену морфин-белок для лечения (вторичной профилактики) зависимости от опиатов - морфина и его производных по гидроксильным остаткам при атомах углерода в положении 3 и 6 фенантренового кольца молекулы морфина.

Спасибо за внимание!