Особенности индикации сальмонелл в различных пищевых продуктах

Индикация сальмонелл в мясе птицы основана на высеве определенного количества продукта (или смывов с его поверхности) на жидкие селективные питательные среды с выделением чистых культур на дифференциально-диагностических средах, изучении морфологических и культурально- биохимических признаков сальмонелл, с дальнейшей их серологической типизацией (идентификацией)

Методика: Берут навеску продукта 25 г (или смыв не менее 25 см 2 ) и высевают в пептонно-буферную воду в соотношении 1:5. Просевы инкубируют 24 ч при температуре 37 0 С. Затем 10 мл культуральной жидкости из пептонно-буферной воды пересевают в 90 мл одной из сред обогащения (Мюллера, Кауфмана, селенитовую, магниевую) и инкубируют в термостате при 37 0 С. Через 24 и 48 ч из среды обогащения делают пересев на две любые дифференциальные среды (Эндо, Левина, ВСА и др.) по выбору и инкубируют в термостате 24 ч, а, если это ВСА, то - 48 часов.

При отсутствии подозрительных колоний на дифференциальных средах работу с посевами прекращают. Подозрительные колонии используют в дальнейших исследованиях, для этого отбирают не менее 5 типичных колоний. Изучают морфологические, тинкториальные, культуральные и ферментативные свойства: определяют способность расщеплять лактозу, глюкозу, сахарозу, манит, мочевину; образование сероводорода и индола, ацетилметилкарбинола (реакция Фогеса-Проскауэра), утилизацию цитрата.

К бактериям рода сальмонелла относят культуры, не ферментирующие лактозу, сахарозу, расщепляющие глюкозу и манит, образующие сероводород и не образующие индол, утилизирующие цитрат и не расщепляющие мочевину.

При обнаружении сальмонелл в партиях тушек птицы, в партиях бескостного кускового мяса – вся партия должна быть направлена на изготовление консервов в соответствии с Правилами ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарной экспертизы мяса и мясных продуктов. Результаты исследований записывают следующим образом: сальмонеллы обнаружены или не обнаружены в 25 г продукта (или в смыве продукта с указанием исследуемой площади в см 2 ).

Стандартный метод выполняется в строгом соответствии с требованиями техники безопасности, предусмотренными санитарными правилами при работе с микроорганизмами IV группы патогенности. Особенности отбора проб пищевых продуктов для анализа, методы их транспортировки и подготовки к исследованиям описаны в методических указаниях. Кратность производственного микробиологического контроля различных пищевых продуктов на содержание сальмонелл проводится в соответствии с требованиями санитарных правил.

Используемая для пред обогащения сальмонелл забуференная пептонная вода богата питательными веществами, что обеспечивает интенсивный рост даже угнетенных бактерий. Фосфатный буфер стабилизирует рН среды и оптимизирует рост сальмонелл. При исследовании сальмонелл предварительное обогащение образца удобнее проводить в закрывающихся пластиковых пакетах. Это исключает необходимость подготовки питательной среды, мытья и автоклавирования лабораторной посуды. В пакетах с 225 мл стерильной забуференной пептонной воды проводят и гомогенизацию, и инкубирование анализируемого образца (при 37±1 °С в течение 18–24 ч). При исходном (1–5 КОЕ/25 г) содержании сальмонелл в анализируемом образце после этапа пред обогащения титр бактерий достигает 10 2 –10 4 КОЕ/мл.

Использование нескольких питательных сред, различающихся по селективности, позволяет унифицировать метод выделения сальмонелл из любых образцов пищевых продуктов, независимо от содержания в них сопутствующих микроорганизмов. Культуральной жидкостью, полученной в результате предварительного обогащения в неселективной жидкой среде, инокулируют среду Раппопорта–Вассилиадиса с соей (RVS-бульон). Параллельно производят селективное обогащение одной из двух сред (по выбору): тетратионатным бульоном Мюллера– Кауфманна (МКТ- бульон) или селенитовой обогатительной средой (ГОСТ Р ). Посевы инкубируют при 37±1 °С в течение 24±3 ч. Эти среды, угнетая развитие других энтеробактерий, избирательны для сальмонелл и способствуют их размножению (до 10 4 –10 6 КОЕ/мл).

Полученные культуры (см. предыдущий пункт) пересевают на 2 газированные дифференциально-диагностические среды, различающиеся по селективности. При этом используют ксилоза- лизин-дезоксихолатный агар (XLD-агар), хромогенный Рамбах- агар (эти среды избирательны для сальмонелл и шигелл, но угнетают рост других энтеробактерий) или одну из агаризованных дифференциально-диагностических сред, например, висмут- сульфитный агар или ксилоза-лизинговый агар с Тергитолом-4 (XLT4-агар).

Принцип селективного определения заключается в ферментации сальмонеллами пропиленгликоля до кислоты. Под действием кислоты смесь рН-индикаторов среды окрашивает колонии сальмонелл в красный цвет. На Рамбах-агаре легко отличить Н 2 S- продуцирующие штаммы Citrobacter от сальмонелл: первые синего, вторые – красного цвета, тогда как на XLD-агаре или висмут-сульфитном агаре дифференцировать Н 2 S-продуцирующие бактерии с сальмонеллами затруднительно. Дезоксихолат натрия ингибирует рост сопутствующих грамположительных бактерий. Посев инкубируется в аэробных условиях при 37±1 °С в течение 24±3 ч. Колонии сопутствующих колиформных бактерий (Е. соli, Klebsiella pneumoniae) сине-зеленой окраски, колонии Shigella и Proteus – бесцветные либо слегка желтоватые. Таким образом, выросшие на Рамбах-агаре колонии сальмонелл легко отличить от всех других представителей семейства энтеробактерий.

Принцип определения сальмонелл основан на продуцировании бактериями сероводорода при их выращивании на высокоселективном XLT4-агаре. При этом колонии сальмонелл черной или красно-фиолетовой (с черным центром) окраски. Оптимальному росту сальмонелл способствуют пептон, дрожжевой экстракт и лизин; тергитол-4 эффективно подавляет рост протея (в отличие от дезоксихолата в XLD-агаре). Это практически полностью исключает возможность ложноположительных результатов при содержании в пробе Н 2 S- продуцирующих штаммов протея. Посев инкубируется в аэробных условиях при 35–37 °С в течение 18–24 ч. Выявление бактерий на XLT4-агаре хорошо дополняет исследования, выполненные на Рамбах-агаре. Селективное выявление сальмонелл – важное преимущество XLT4-агара при исследовании таких продуктов, как мясной фарш, содержащий большое количество сопутствующей микрофлоры.

Полученные на агаризованных средах колонии, предположительно относящиеся к сальмонеллам, выделяют для последующей биохимической идентификации. При этом удобно использовать наборы уже готовых стандартных тест-систем, например, систему Crystal. Идентификатор микроорганизмов Crystal позволяет определять более 500 видов микроорганизмов, включая разные виды сальмонелл и других энтеробактерий. Основу системы составляют диагностические тест-панели с субстратами. Они позволяют по биохимическому профилю определить вид исследуемого организма. Преимуществами системы являются одноэтапное внесение исследуемого материала, отсутствие дополнительных реагентов, удобство, безопасность и точность исследования, а также экономичность метода.

На питательных средах большинство сальмонелл обра­ зует небольшие, диаметром 24 мм, колонии. Ряд серова­ров (S. abortusequi, S. abortus ovis, S. typhisuis) образует более мелкие колонии, диаметром около 1 мм. Колонии сальмонелл на питательном агаре прозрачно - голубоватого цвета. При посеве на среду Эндо они слега розоватые, прозрачные; на среде Плоскирева бесцветные, выглядят более плотными и мутноваты. На висмут сульфит агаре колонии всегда черного цвета, с металлическим блеском. Питательная среда под колонией окрашена в черный цвет. Ряд сероваров, в частности S. рагаtyphi С, образует на этой среде светлые, зеленоватые колонии.

Устойчивость этих бактерий к воздействию часто встречаемых физических и химических факторов высокая. Они могут длительное время выживать в пыли, навозе, сухом кале, почве, воде и животных кормах, сохраняя вирулентность. В воде открытых водоёмов и питьевой воде они живут сут, в морской воде сут, в почве 1-9 мес, в комнатной пыли сут,. В сухом кале крупного рогатого скота сальмонеллы сохраняются до 4-х лет. Сальмонеллы переживают в течение длительного времени на керамических, металлических и стеклянных предметах соответственно 70, 55 и 43 дня.

Наиболее устойчива S. typhimurium, остающая­ся жизнеспособной на тканях и на бумаге до года. Выдерживают 5-6 кратное замораживание и оттаивание. Выживание сальмонелл в различных пищевых продуктах неодинаково. Мясо, молоко - являются благоприятной средой для размножения. В сыре, масле, они не размножаются, но не теряют жизнеспособность. В мясе, хранящемся на холоде, эти микроорганизмы также сохраняются, а при повышении температуры до 5°С и выше начинают размножаться. В мороженом мясе живут до 3-х лет, в колбасных изделиях – до 130 дней, яйцах – до 13 месяцев, яичном порошке – до 9 месяцев, на за­ мороженных овощах и фруктах 0,5-2,5 мес.

При температуре ниже 5°С роста сальмонелл в течение 3-х недель не наблюдают; при 5-8°С в первые два дня рост мало замечен, а после 3-4 дней идет интенсивное размножение. При 8-13°С интенсивный рост отмечается уже через 12 часов. Из замороженных яичных желтков сальмонеллы выделяются после 13-ти месяцев хранения этих продуктов при –20°C. Соление и копчение слабо действуют на них. В соленом и копченом мясе, при содержании 12-19% поваренной соли бактерии погибают через 75 дней, при 10-11%-ном содержании соли они остаются жизнеспособными даже после 80 дней. В мясном рассоле с содержанием 29% соли при 6-12°С сальмонеллы сохраняют жизнеспособ­ность от 4 до 8 месяцев, а в свиных кишках, содержащих 22% соли, в течение 6 месяцев.Сальмонеллы чувствительны к воздействию кислот.

В свинине, массивно инфицированной сальмонеллами, бактерии отмирают через 14 дней после введения в толщу мяса 10%-ной уксусной кислоты и последующей заливки его этой кислотой. Хранение сырого молока при 18-20°С и кислотности 26°Т (T- кислотность по Тернеру) сальмонеллы в нем выживают в течение 11 суток, а при снижении температуры до 5-8°С – до 20 суток. В простокваше с кислотностью 85°Т и хранящейся при температуре 0-4°С данные бактерии способны к размножению в течение 2-х суток. В простокваше с кислотностью в °Т эта способность сохраняется в течение 24-х часов. Сальмонеллезные бактерии достаточно устойчивы к воздействию высокой температуры. Нагревание при 70 °С выдерживают в течение 30 мин.

Устойчивость к высокой температуре повышается, когда сальмонеллы находятся в пищевых продуктах, особенно в мясе. Мясо, зараженное сальмонеллами и заложенное в холодную воду, становится стерильным в кусках весом не более 400,0 граммов при толщине кусков 19 см и варке в течение 2,5 час; а при закладке в кипяток стерильность за тот же срок варки достигается лишь в кусках весом до 200,0 граммов, при толщине их 5,0-5,5 см. Пастеризация молока при 85°С в течение 30 минут вызывает инактивацию сальмонелл.