ИСПЫТАНИЯ НА ПИРОГЕННОСТЬ

К инъекционным и инфузионным растворам предъявляется ряд требований: отсутствие механических включений (прозрачность), стабильность, стерильность, апирогенность и специальные требования (осмолярность, соответствующий ионный состав, значение рН, изо вязкость и др.).

Пирогенные вещества (греч. pyr - огонь +gennao - создавать, производить) - биологически активные вещества экзогенного (бактериального и вирусного) и эндогенного (клеточно-тканевого) происхождения, обладающие свойством вызывать перестройку уровня регуляции температурного гомеостаза, приводящую к повышению температуры тела и развитию лихорадки. Первоначально это явление было описано в 1865 г. при парентеральном введении дистиллированной воды. В 1876 г. впервые появился термин «пироген» применительно к веществам, выделенным из гниющего мяса. В 1891 г. С. П. Боткин установил, что одной из причин лихорадочной реакции при брюшном тифе является образование тканевых пирогенов. В период г. г. было установлено, что пирогенная реакция вызывается как живыми, так и погибшими микроорганизмами. В 1923 г. F. B. Seibert выделил пирогенные вещества из растворов, установил их термостабильность и первым обосновал использование кроликов для изучения пирогенной реакции.

Эндогенные пирогены – это клеточно-тканевые продукты, образующиеся в определенных условиях. Основным источником эндогенных пирогенных веществ являются моноциты крови, альвеолярные и перитонеальные макрофаги, фиксированные макрофаги селезенки и печени, а также нейтрофильные гранулоциты и эозинофилы (лейкоцитарный пироген); они спонтанно синтезируются клетками некоторых опухолей.

Экзогенные пирогены – это вещества, содержащиеся в микробах и выделяющиеся в процессе их жизнедеятельности. Экзогенные пирогенные вещества не действуют непосредственно на центры терморегуляции; их пирогенная активность опосредуется через образование вторичных, эндогенных, пирогенных веществ в организме (липополисахариды грамотрицательных бактерий).

Источниками пирогенных веществ в лекарственных средствах в большинстве случаев являются микроорганизмы: грамотрицательные бактерии, грибы вирусы. Кроме того, пирогенную реакцию могут вызывать некоторые химические вещества: продукты термоокислительной деструкции пластмасс (например, фторопластов), суспензия фосфата кальция, нуклеинат натрия и другие химические вещества.

Носителем пирогенности является эндотоксин (0-антиген), присутствующий в клеточной оболочке микроорганизмов и составляющий от 1 до 5 % сухой массы бактериальных клеток. Эндотоксин – это липополисахарид о-протеине-липоидный комплекс. Сложный протеин Липид В + Липополисахарид «деградированный» нетоксичный фосфорилированный полисахарид - + свободный липид А - определяет пирогенность и токсичность пирогенов Не обладают пирогенной активностью

Проверке на пирогенность подвергают Растворы, вводимые внутривенно в объемах 10 мл и более (ГФ XI). 5% раствор глюкозы, Изотонический раствор натрия хлорид, 10% раствор желатина Один раз в квартал (приказ Минздрава 573 от г.) проводят испытание на пирогенность воды для инъекций Препараты, получаемые из природного сырья (антибиотики, ферменты, экстракты из печени, препараты крови, лизаты белков и т. п.). Вода и другие жидкости, используемые для промывания флаконов, ампул, приборов для инфузий, изделий из стекла, пластмассы и резины, в которых содержатся или с которыми соприкасаются препараты для вливания; Шприцы одноразового использования; Пластмассы и резины, применяемые при изготовлении растворов для инъекций.

Биологический метод (испытание на кроликах) Согласно ГФ XI испытание пирогенности проводят на кроликах (биологический метод). Берут кроликов обоего пола массой от 1,5 до 2,5 кг, содержащихся в строго регламентированных условиях и имеющих исходную ректальную температуру от 38,5 0 С до 39,5 0 С. Стерильные испытуемые растворы, подогретые до 37 0 С, вводят кроликам в ушную вену. Испытание каждого раствора проводят на 3 кроликах, измеряя ректальную температуру 3 раза с промежутками 1 ч.

Вода или раствор лекарственного вещества считаются непирогенными, если после введения ни у одного из трех подопытных кроликов ни при одном из трех измерений не наблюдалось повышение температуры более, чем на 0,6 0 С по сравнению с исходной температурой, и в сумме повышение температуры у 3 кроликов не превышало 1,4 0 С. Если эта сумма превышает 2,2 0 С, воду для инъекций или исследуемый раствор лекарственного средства считают пирогенным. Когда сумма повышений температуры тела у трех кроликов находится в пределах от 1,5 до 2,2 0 С, испытание повторяют дополнительно на пяти кроликах.

Лимулус-тест (LaL-тест) В настоящее время наиболее перспективным методом испытания на пирогенность можно считать лимулус-тест (LaL-тест). Метод основан на способности лизированных клеток (амебоцитов) крови крабов Limulus poliphemus реагировать с бактериальными пирогенными эндотоксинами, образуя гель.

Лимулус-тест проводят, смешивая в асептических условиях в пробирке 0,1 мл испытуемого раствора с 0,1 мл LaL. Смесь инкубируют при 370С в течение от 15 до 90 мин при рН от 6,0 до 8,0, не подвергая ее встряхиванию. При наличии пирогенных эндотоксинов грамотрицательных бактерий образуется гель, который обнаруживается по увеличению вязкости смеси, потере ею текучести. При повороте пробирки на 1800 гель не должен разрушаться.

Труднодоступные и малоиспользуемые методы определения пирогенных веществ в лекарственных средствах Полярография. Но по чувствительности обнаружения пирогенных веществ на 2 порядка уступает биологическому испытанию на кроликах. Методика люминесцентного анализа. Но не может широко использоваться, так как она осуществляется с применением малодоступного и дорогого флуориметра марки СДЛ-1. Методика определения оптической плотности. Но она требует использования малодоступных кварцевых кювет с толщиной слоя 10 см или же труднодоступной аппаратуры для концентрирования пирогенов методом ультрафильтрации с применением специальных мембранных фильтров.