МЕТОДИКА ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР (4, 5 ДЕНЬ ИССЛЕДОВАНИЯ ) БАКТЕРИОФАГИ

Протокол (окончание). Методика выделения чистых культур (4, 5 день исследования). Дата, день исслед-я Исследуемый материал Что сделать Результат Культура 1 Культура 2 4 день 1. Посевы выделенных культур на среде Гисса с глюкозой и питательном бульоне с индикаторами на индол и сероводород 2. Рост стафилококка на МПБ 1)Изучить характер роста на МПБ 2)Оценить биохимические свойства: ферментацию глюкозы, образование индола, сероводорода 3) Пользуясь учебной таблицей-определителем, сделать заключение о видах выделенных культур 1)Произвести посев 0,1 мл культуры бактерий на питательный агар методом газона. 2) Нанести пипеткой на размеченные квадраты соответствующие бактериофаги. 3)Инкубировать при Т=30ºС часов. 1)_________________ ___________________ 2) Глюкоза: Индол:____________ H 2 S _______________ _________________ Глюкоза: Индол:___________ H 2 S ______________ Заключение:

Дата Исследуемый материал Что сделать Результат 5 день Выращенные посевы (фаготипирование) Определить образование негативных колоний. Определить фаговар и фагогруппу S.aureus. Заключение: ____________________________ _______________________________________

Изучение биохимических свойств КИСЛОТА ГАЗ ОТРИЦАТЕЛЬНО ИНДОЛ + СЕРОВОДОРОД + СРЕДА ГИССА С ГЛЮКОЗОЙ ПИТАТЕЛЬНЫЙ БУЛЬОН

ТАБЛИЦА – ОПРЕДЕЛИТЕЛЬ ВИДА БАКТЕРИЙ ВИД МОРФОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ МОРФОЛОГИЯ КОЛОНИЙ РОСТ НА МПБ ФЕРМЕНТАЦИЯ ГЛЮКОЗЫ ОБРАЗОВАНИЕ ИНДОЛА Образование сероводорода Staphylococcus aureus Мелкие кокки располагаются гроздьями Грам + Колонии с золотистым пигментом, гладкие, блестящие, выпуклые, 1-2 мм, с ровным краем Равномерное помутнение К -+ Sarcina ventriculi Кокки средних размеров, располагаются пакетами 8-16 и более клеток, Грам + Колонии с желтым пигментом, гладкие, блестящие, 1-3 мм, край ровный Помутнение осадок КГ - + -

ВИД МОРФОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ МОРФОЛОГИЯ КОЛОНИЙ РОСТ НА МПБ ФЕРМЕНТАЦИЯ ГЛЮКОЗЫ ОБРАЗОВАНИЕ ИНДОЛА ОБРАЗВАНИЕ СЕРОВОДОРОДА Streptococcus pyogenes Сферические или овальные, располагаются парами или цепочками Грам + Колонии очень мелкие, бесцветные, прозрачные, гладкие, блестящие Придонный рост К - - Serratia marcescens Палочки средних размеров, располагаются одиночно Грам - Колонии с красным водорастворимым пигментом,, 2-3 мм Равномерное помутнение КГ + - -

ВИД МОРФОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ МОРФОЛОГИЯ КОЛОНИЙ РОСТ НА МПБ ФЕРМЕНТАЦИЯ ГЛЮКОЗЫ ОБРАЗОВАНИЕ ИНДОЛА ОБРАЗОВАНИЕ СЕРОВОДОРОДА Escherichia coli Палочки средних размеров, располагаются одиночно Грам - Колонии бесцветные, полупрозрачные, гладкие, блестящие, 2-5 мм, с волнистым краем. Равномерное помутнение КГ Shigella dysenteriae Палочки средних размеров располагаются одиночно Грам - Колонии бесцветные, полупрозрачные, гладкие, блестящие, 2-5 мм, с волнистым краем. Равномерное помутнение К - -

Свойства фагов как вирусов неклеточная форма жизни содержат одну нуклеиновую кислоту – ДНК или РНК отсутствуют белоксинтезирующие системы и самостоятельный метаболизм облигатные внутриклеточные паразиты на генетическом уровне

История открытия бактериофага В 1896 году Эрнест Хэнкин установил наличие выраженной антибактериальной активности воды из Ганга и Джамны в отношении холерного вибриона. В 1898 г. Н.Ф. Гамалея наблюдал спонтанный лизис сибиреязвенных бактерий. В 1915 г. английский бактериолог Ф. Туорт описал способность фильтрата стафилококков растворять свежую культуру этих же бактерий. В 1917 г. французский ученый Ф.Д. Эррель подробно изучил взаимодействие фага и бактерий и сделал заключение, что открытый им литический агент является вирусом бактерий и назвал его «бактериофагом» пожирателем бактерий.

Морфология бактериофагов Фаги 1 типа – нитевидные фаги Фаги 2 типа – представлены головкой и рудиментом хвоста Фаги 3 типа – представлены головкой и коротким хвостом (Т-фаги 3 и Т-фаги 7) Фаги 4 типа – фаги с несокращающимся хвостом (Т-фаги 1 и Т-фаги 5) Фаги 5 типа – фаги с сокращающимся чехлом (Т-фаги 2 Т-фаги 4)

Строение Т-чётного фага

Химический состав фагов Белки Нуклеиновые кислоты – ДНК или РНК Небольшое количество углеводов Нейтральные жиры

Взаимодействие фагов с бактериями может протекать: по продуктивному типу – образуется фаговое потомство и бактерии лизируются по абортивному типу – фаговое потомство не образуется и бактерии сохраняют свою жизнедеятельность по интегративному типу – геном фага встраивается в хромосому бактерии и сосуществует с ней

Виды бактериофагов вирулентные фаги вызывают продуктивную инфекцию, при которой происходит репродукция фагов и лизис бактериальной клетки умеренные фаги встраиваются в генетический аппарат бактериальной клетки, не вызывая ее лизис (существуют в виде профага)

Репродукция вирулентного ДНК-содержащего бактериофага Адсорбция – взаимодействие фага с рецепторами на поверхности бактериальной клетки Проникновение в клетку (инъекция нуклеиновой кислоты) Синтез фаговых белков Репликация нуклеиновых кислот Выход дочерней популяции

Адсорбция бактериофага

Внедрение бактериофага

Репродукция вирулентного и умеренного бактериофага Лизогения Продуктивный тип Бактериофаг Хромосома Бактерия

Взаимодействие вирулентного фага с бактериальной клеткой

Лизогения способности бактериальной культуры в бесчисленном ряду поколений нести в своем составе фаг в особой неинфекционной форме, называемой профагом. Бактерии, в составе которых есть профаг, называются ЛИЗОГЕННЫМИ

Лизогенная (фаговая) конверсия - изменение свойств микроорганизмов под влиянием профага. Изменение генотипа или фенотипа бактерий в результате фаговой конверсии приводит к изменению культуральных, биохимических, токсигенных, антигенных свойств, чувствительности к антибиотикам

25 Трансдукция – передача бактериальной ДНК посредством бактериофага Эстер Ледерберг была первой учёной, кому удалось выделить бактериофаг лямбда, ДНК вирус, из Escherichia coli K-12 в 1950 году. Собственно открытие трансдукции связано с именем американского учёного Джошуа Ледерберга. В 1952 году он совместно с Нортоном Циндером обнаружил общую трансдукцию. В 1953 Ледербергом и др. было показано существование абортивной трансдукции, в 1956 специфической.

26 Неспецифическая (общая) трансдукция – это перенос бактериофагом (Р-фагом) фрагмента любой части бактериальной хромосомы: 1. Бактериальная ДНК фрагментируется после фаговой инфекции 2. Фрагмент бактериальной ДНК (размером с фаговую ДНК) интегрирует в вирусную ДНК и образует дефектную частицу. Частота 1 на 1000 фаговых частиц. 3. Последующее инфицирование дефектной частицей – рекомбинация с гомологичным участком реципиентной хромосомы и образование стабильного генома.

Специфическая трансдукция Фаговая ДНК интегрирует в бактериальную хромосому с образованием профага (обычно в специфичном участке) При исключении ДНК фага захватывается прилегающий фрагмент бактериальной хромосомы и образуется дефектный фаг. Последующее инфицирование дефектной частицей – сайт- специфическая рекомбинация. Рекомбинант становится меродиплоидным по привнесенному гену (например, gal-ген у E.coli )

28 Трансдукция с высокой частотой (HFT от англ. high frequency transduction) – реализация дефектного трансдуцирующего фага при помощи вспомогательного. Абортивная трансдукция - внесённый фрагмент ДНК донора не встраивается в геном реципиента, а остаётся в цитоплазме.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ФАГОВ

Применение вирулентных бактериофагов: Фагопрофилактика - способ предупреждения развития заболеваний в очагах инфекции посредством применения коммерческих препаратов бактериофагов (бактериальной дизентерии, холеры, сальмонеллеза и др.). Фаготерапия – метод лечения инфекционных заболеваний посредством применения коммерческих препаратов бактериофагов, к которым чувствительны возбудители.

Фагодиагностика - метод идентификации выделенных культур микроорганизмов, основанный на способности диагностических фагов лизировать чувствительные бактерии. Фагоиндикация – способ выявления бактериального загрязнения, когда присутствие фага рассматривается как косвенный показатель загрязненности исследуемого материала.

Применение умеренных фагов: 1) на лизогенных бактериях изучают механизмы функционирования различных генов; с помощью трансдукции устанавливают локализацию генов на бактериальной хромосоме, 2) лизогенные бактерии используются при поисках противоопухолевых веществ: если препарат обладает индуцирующими свойствами, т.е. он взаимодействует с нуклеиновыми кислотами, и его можно испытывать как противоопухолевый препарат, 3) лизогенные штаммы используют при изучении различных мутагенных факторов (излучение), 4) умеренные фаги широко используются в генной инженерии. Модель "профаг - клетка" лежит в основе вирусогенетической гипотезы происхождения опухолей.

Препараты бактериофагов с лечебной и профилактической целью выпускаются в виде Таблеток Мазей Аэрозолей Свечей Суспензии

Преимущества лечебно-профилактических бактериофагов Высокая специфичность в отношении штаммов-хозяев Не токсичны Не угнетают нормальную микрофлору Не подавляют иммунную защиту Не вызывают аллергических реакций Могут применятся с антибиотиками и иммунопрепаратами

Синдром диабетической стопы

Лечебно-профилактические бактериофаги по составу подразделяются: Монокомпонентные - лекарственные средства, содержащие вирулентные фаги против одного рода или вида бактерий Комбинированные – лекарственные средства, содержащие несколько видов монокомпонентных бактериофагов

Лечебно-профилактические бактериофаги и их целевая направленность Наименование препарата бактериофага Специфическая направленность Монокомпонентные Стафилококковый Staphylococcus spp. (S. aureus) Стрептококковый Streptococcus spp. (в том числе, Enterococcus spp.) Псевдомонас аеругиноза (синегнойный) Pseudomonas aeruginosa Коли Escherichia coli Протейный Proteus mirabilis и P. vulgaris Дизентерийный поливалентный Shigella flexneri 1,2,3,4,6 сероваров; S.sonnei Брюшнотифозный Salmonella typhi Сальмонеллезный гр. АВСДЕ S. typhimurium, S. paratyphi A, S.paratyphi B, S. heidelberg, S. newport, S. choleraesuis, S. oranienburg, S.infantis. Клебсиелл пневмонии Klebsiella pneumoniae

Комбинированные Коли-протейный E. coli, P. mirabilis и P. vulgaris Клебсиеллезный поливалентный K. pneumoniae, K. ozaenae, K. rhinoscleromatis Пиобактериофаг поливалентный очищенный Staphylococcus spp., Streptococcus spp., P. mirabilis, P.vulgaris, E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae Секстафаг® Пиобактериофаг поливалентный Staphylococcus spp., Streptococcus spp., P. vulgaris, P.mirabilis, P. aeruginosa, K. pneumoniae, E. coli Пиобактериофаг комплексный Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., P. mirabilis, P. vulgaris, E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae, K. oxytoca Интести S. flexneri 1, 2, 3, 4, 6 сероваров, S. sonnei, S. typhimurium, S. paratyphi A, S. paratyphi B, S. heidelberg, S. newport, S. choleraesuis, S. oranienburg, S. infantis, S. dublin, S. enteritidis, S. anatum, S. newlands, P. mirabilis и P. vulgaris, E.coli, Enterococcus spp., Staphylococcus spp., P. aeruginosa

Фагодиагностика Фаготипы (фаговары) - представители одного вида бактерий, отличающиеся по чувствительности к бактериофагам Фаготипирование

Фаготипирование S.aureus Питательный агар культура S.aureus в МПБ Дно засеянной чашки расчерчивают маркером на 23 квадрата (по числу типовых бактериофагов) 0,1 мл Посев газоном

Фагогруппы S. aureus Фагогруппы Номера бактериофагов I29, 52, 52А,79, 80 II3А, 3С, 55, 71 III6, 42Е, 47, 53, 54, 75, 77,83А, 84, 85 V94, 96 Вне групп 81,95

Негативные колонии бактериофага прозрачные пятна на питательной среде

Одна и та же культура может лизироваться разными фагами, из чего складывается профиль фагочувствительности (фагомозаика) штаммов. Так как число подобных спектров велико и на практике их трудно учитывать, фаги объединены в группы. Каждый штамм относится к одной из фагогрупп и соответствующему фаготипу; предпочтение отдают фагам с наибольшей литической активностью. Совпадение фагомозаики у штаммов, изолированных от разных больных, говорит об общем источнике инфекции.

Титрование бактериофага на плотной (метод Грациа) и жидкой (метод Аппельмана) питательных средах

Приготовление серийных разведений бактериофага Бактериофаг 4,5 мл мясо-пептонного бульона 0,5 мл ,5 мл сброс ,5 мл МПБ Контроль стерильности среды (без бактериофага) ,5 мл ,5 мл Титрование стафилококкового бактериофага по Аппельману

Внесение культуры бактерий 0,03 мл Суточная культура бактерий (1×10 9 КОЕ/мл) 10-кратные разведения бактериофага Контроль роста бактерий 0,03 мл 4,5 мл МПБ

Учет Роста микроорганизмов нет Рост микроорганизмов Контроль (МПБ без бактериофага) Контроль роста бактерий

Дата, день Исследуемый материал Что сделать Результат 1 день Бактериофаг стафилококковый 1. Приготовить 10-кратные разведения бактериофага в МПБ. 2. Внести суточную агаровую культуру S.aureus. 3. Инкубировать в при Т=37ºС 18 часов. 2 день Титрование по Аппельману 1. Провести учет результатов (наличие или отсутствие роста, результаты внести в таблицу. 2. Определить титр стафилококкового бактериофага. Титр= Протокол. Титрование стафилококкового бактериофага по методу Аппельмана

пробирок, Разведение бактерио- фага Ингредиенты Контроль роста бактерий Контроль стериль- ности среды МПБ с бактериофагом, мл 4,5 - 4,5 мл МПБ без фага Суточная агаровая Культура бактерий, мл (1×10 9 КОЕ/мл) 0,03 0,03+4,5 мл МПБ - Инкубация в термостате Т=37 º С 18 часов Учет (наличие или отсутствие роста микробов) протокол

Титрование стафилококкового бактериофага по методу Грациа Бактериофаг 4,5 мл мясо-пептонного бульона 0,5 мл ,5 мл сброс ,5 мл ,5 мл Приготовление серийных разведений бактериофага

бактериофаг 1 мл расплавленный и остуженный до 45°С 0,7% МПА 5 мл 0,2±0,05 мл 18-часовая бульонная культура бактерий Содержимое пробирки быстро перемешать вращением пробирки между ладонями и вылить в чашку вторым слоем

Подсчет фаговых частиц N= n×D N- количество фаговых частиц в 1 мл исследуемого материла n- количество негативных колоний в чашке D- степень разведения фага в чашке

Дата Исследуемый материал Что сделать Результат 1 день Бактериофаг стафилокок- ковый 1. Приготовить десятикратные последовательные разведения бактериофага. 2. Смешать 1 мл фага из пробирок с разведениями c расплавленным и остуженным до Т=45°С 0,7 % МПА. 3. Внести 0,2 мл 18-часовой бульонной культуры S. aureus. 4. Содержимое пробирок перемешать и вылить вторым слоем на поверхность 1,5% МПА в чашках Петри. 5. Чашки инкубировать при Т=37° С в течение 18 часов. 2 день Выращенные посевы 1. Подсчитать количество негативных колоний. 2. Используя формулу N= n × D, определить количество фаговых частиц в 1 мл фага, выразив в КОЕ/мл. 3. Результат внести в таблицу. Титр= Протокол. Титрование стафилококкового бактериофага по методу Грациа

Разведение бактериофага Ингредиенты Контроль Бактериофаг, мл 1, часовая бульонная культура бактерий, мл 0,2 МПА, мл 5,0 Инкубация в термостате Т=37 º С 18 часов. Учет (количество негативных колоний) протокол

Инновационные направления применения бактериофагов 1.Бактериофаг- опосредованный биоконтроль Обработка сельскохозяйственных растений и животных на этапе, предшествующем их попаданию на перерабатывающие заводы (овощи, фрукты до сбора урожая; мясной и молочный скот, домашняя птица до забоя) 2. Фаговый биопроцессинг Деконтаминация и продление срока годности овощей, фруктов, мяса, рыбы и т.д. в процессе их заводской переработки перед упаковкой полуфабрикатов и готовой к употреблению продукции 3. Фагопрофилактика Снижения риска развития спорадических случаев и эпидемических вспышек кишечных и нозокомиальных инфекций путем перорального профилактического приема бактериофагов 4. Фагокосмецевтика Альтернатива бактериостатическим косметическим и гигиеническим средствам 5.Фаг-опосредованная биодезинфекция Дезинфекция помещений и инструментария лечебно- профилактических учреждений и пищевых производств средствами на основе бактериофагов 6. Фагоидентификация Индикация и идентификация потенциально опасных микроорганизмов с помощью фаговых диагностикумов