АДАПТАЦИЯ МИКРОКЛОНОВ ВЕЙГЕЛЫ ЦВЕТУЩЕЙ «ВАРИЕГАТА» К УСЛОВИЯМ СОЛЕВОГО И МЕДНОГО СТРЕССОВ О.А.ЗЕМЛЯНУХИНА, В.Н.КАЛАЕВ, В.С.ВОРОНИНА Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Воронежский государственный университет»

Первичное засоление: вымывание легкорастворимых солей из почвы за счет обильных дождей или мелиоративных мероприятий; Засоление вызывается частым использованием хлористого калия и натрия, фосфорных составов, аммиачной селитры и навоза КРС, содержащего в себе соль-лизунец. Наиболее значим NaCl; Вторичное засоление: на тяжелых грунтах не устраивают дренажные системы, что приводит к засолению верхнего горизонта; Солеустойчивость - способность растений расти на засоленных почвах. К ним относятся галофиты: 1)солянки (эвгалофиты или настоящие галофиты), клетки которых имеют очень устойчивую к высоким концентрациям соли протоплазму, обладающие мясистыми листьями и стеблями: солерос, света, пустынные полукустарники; 2)криногалофиты, способные выделять соли специальными железами, расположенными в листьях и стеблях. В дальнейшем соли под влияем ветра распыляется в окружающую среду: произрастающие в пустынях и сухих степях виды кермека и тамариксов; 3)гликогалофиты, их корневая система непроницаема для солей, за счет этого в тканях не накапливаются вредные соединения: различные виды полыни, распространенные на засоленных полупустынях. Среди культурных растений представителей галофитов нет, поэтому их называют гликофитами. Вейгела – гликофит. Засоление

Загрязнение ионами тяжелых металлов По загрязнению тяжелыми металлами почвы г. Воронежа относятся к умеренно опасным; Большинство ионов металлов являются эссенциальными элементами; Медь по степени токсичности в ряду Ирвинга- Вильямса является наиболее токсичным металлом; Превышение нормальных концентраций меди приводит к хлорозу, некрозу, нарушениям митоза, карликовости, увеличением боковых корней; Повышение синтеза и накопления моносахаров, увеличивающих осмотическое давление в клетках;

Физиологическая адаптация к засолению и ионам тяжелых металлов Окислительный стресс активные формы кислорода антиоксидантные ферменты увеличение ненасыщенности липидов; Увеличение синтеза органических кислот (малат, цитрат, изоцитрат и др.), что приводит к хелатированию металлов и выведению их корнями (Munns,2008); Накопление солей и ионов в вакуолях (Gupta,2013); Секреция корнями слизи (содержит органические кислоты и белки связывания); Изменение количества и функций макромолекул (ферментов); Изменение эпигенетических параметров, направляющих функции генов в нужном направлении; Увеличение количества свободного пролина, участвующего в антиоксидантных, протекторных, энергетических процессах, обеспечивая нормальную жизнедеятельность растительного организма при стрессе

Экспериментальные условия Объект исследования: Вейгела цветущая «вариегата»; Культуральные условия: без гормональная питательная среда ½ WPM; Селективные среды: в 12 биологических повторностях; полулетальные концентрации морской соли (130 mM хлорида натрия) и ионов меди (0,075 mM Сu 2+ ); Биохимические исследования: пероксидаза (ПО; КФ ), глюкозо-6-Ф- дегидрогеназа (гл.-6-Ф-ДГ; КФ ), NADH-дегидрогеназа (NADH-ДГ; ) изоцитратлиаза (ИЦЛ; КФ ), изоцитратдегидрогеназа (ИДГ; КФ ), малатдегидрогеназа (МДГ; КФ ), малик энзим (МЭ; КФ ). Определение пролина по методу Бэйтса; Определение белка по Брэдфорду; Электрофорез по методу Дэвиса; Вычисление корреляций для проведения факторного анализа с использованием коэффициент корреляции Спирмена. Выбор числа общих факторов с использованием критерия Кеттелла. Приводятся только достоверные результаты (пакет статистических программ «Stadia»

Вейгела цветущая «вариегата» (Weigela florida «Variegata» Bunge A.D.C.): исходный куст, этапы микро клонирования, адаптированные к нестерильному грунту растения

Изменения метаболизма Развитие окислительного стресса и изменения в функционировании антиоксидантной системы Изменения в функционировании цикла трикарбоновых кислот Изменения в функционировании пентозофосфатного цикла и цикла оксалоацетата Изменение содержания растворимого белка Изменение в содержании свободного пролина

Сутки эксперимента Концентрация соли, mM контроль 26mМ43mM87mМ Δ, мм 14 9,50±3,0718,75±4,4413,80±5,2128,50±2, ,80±9,6015,00±2,049,50±3,5715,00± ,30±2,849,00±2,946,00±0,5811,80±2,93 Суммарный прирост 35,00±6,7342,80±5,5429,30±8,5253,00±3,58 Влияние различных концентраций хлорида натрия на рост регенератов вейгелы цветущей «вариегата»

Удельная активность ферментов в контрольных и опытных растениях вейгелы в первом и третьем пассажах * – различия с третьим пассажем достоверны (P<0.05); а – различия с контролем достоверны (P<0.05); q – различия с солью достоверны (P<0.05).

Изменение содержания общего белка клетки микро клонов вейгелы цветущей Обозначения: *- различия с контролем достоверны (P< 0,05), h - различия с третьим пассажем достоверны (P<0,05), j - различия с солью достоверны (P<0,05).

Белковый спектр растений вейгелы цветущей

Изменение содержания аминокислоты пролина в клетках микро клонов вейгелы цветущей

Пентозо-фосфатный цикл и цикл оксалоацетата различия с контролем достоверны (P<0,05)

Удельные активности пероксидазы и NADH-дегидрогеназы

Удельные активности ферментов ЦТК: малатдегидрогеназный комплекс различия с контролем достоверны (P<0,05)

Проекции нагрузок (ось Х - 1 фактор, ось Y - 2 фактор) в факторном анализе адаптационного поведения ферментов при долговременном стрессе в условиях in vitro (120 суток)

Адаптационные факторы Действие солевого стресса Действие медного стресса Условия in vitro (онтогенетическое взросление): увеличение активности NADH-ДГ в 1.9 раза; ИЦЛ в 5.4 раза; МДГ в 12.3 раза; снижение активности гл.-6- Ф-ДГ в 1.8 раза, МЭ в 2 раза; ПО на постоянном уровне Функции ферментов: МДГ, МЭ – цикл трикарбоновых кислот (МТХ); NADH- дегидрогеназа – ЭТЦ (МТХ); ИЦЛ – цикл оксалоацетата (цитоплазма); гл-6-Ф-ДГ – ПФЦ (цитоплазма); ПО – антиоксидантный внецикловый фермент

ВЫВОДЫ Разработан метод активно пролиферирующей культуры вейгелы цветущей «вариегата» в условиях in vitro Получены растения-регенеранты, адаптированные к летальным концентрациям морской соли и ионам меди Процесс адаптации сопровождается изменениями в метаболизме 6 ферментов различных клеточных циклов Наименьшие изменения наблюдаются в активности NADH-ДГ (вероятно,за счет большого пула свободного NADH) Ферменты малатдегидрогеназного комплекса – NADH- МДГ и NAD-МЭ наиболее подвержены влиянию солевого и медного стрессов Глюкозо-6-Ф-ДГ и ИЦЛ могут быть использованы для детекции адаптации древесных растений

К концу адаптации происходит выравнивание у регенератов: oколичества белка oколичества пролина oактивности пероксидазы, изоцитратлиазы, глюкозо-6- фосфатдегидрогеназы Впервые показан высокий конститутивный уровень пролина у растений в культуре ткани, что свидетельствует о стрессовой природе условий in vitro

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!