Роль точечных мутаций гена RUNX1 в патогенезе миелодиспластических и миелопролиферативных заболеваний у детей Диссертация Магистрантки кафедры генетики биологического факультета БГУ Мишковой О.А. Научный руководитель К. б. н., доцент Гринёв В.В.

Оглавление 1. Актуальность темы. Актуальность темы. Актуальность темы. 2. Цели и задачи. Цели и задачи. Цели и задачи. 3. Объект и предмет исследований. Объект и предмет исследований. Объект и предмет исследований. 4. Научная гипотеза. Научная гипотеза. Научная гипотеза. 5. Основные результаты. Основные результаты. Основные результаты. 6. Научная новизна. Научная новизна. Научная новизна. 7. Положения, выносимые на защиту. Положения, выносимые на защиту. Положения, выносимые на защиту. 8. Конференции и публикации. Конференции и публикации. Конференции и публикации. 9. Благодарности. Благодарности. 10. Спасибо за внимание Спасибо за внимание Спасибо за внимание 11. Приложение Приложение

1. Актуальность темы Нарушение транскрипционной регуляции – это одно из ключевых событий в процессе лейкемогенеза. В последнее время были охарактеризованы некоторые участники, имеющие критическое значение для этого процесса. Одним из них является продукт гена RUNX1. Нарушение транскрипционной регуляции – это одно из ключевых событий в процессе лейкемогенеза. В последнее время были охарактеризованы некоторые участники, имеющие критическое значение для этого процесса. Одним из них является продукт гена RUNX1. Роль мутаций гена RUNX1 в альтернативных путях кооперации мутаций в процессе лейкемической трансформации представляет большой интерес. Принято считать, что мутации в этом гене принадлежат к группе II событий, приводящих к нарушению регуляции процесса дифференциации клеток. В то время как мутации группы I проявляются в нарушении пролиферации. У пациентов с миелодиспластическим синдромом/острым миелоидным лейкозом (МДС/ОМЛ) и мутацией в RUNX1, последние чаще всего наблюдаются в NRAS, FLT3, JAK2 и с-KIT генах. Роль мутаций гена RUNX1 в альтернативных путях кооперации мутаций в процессе лейкемической трансформации представляет большой интерес. Принято считать, что мутации в этом гене принадлежат к группе II событий, приводящих к нарушению регуляции процесса дифференциации клеток. В то время как мутации группы I проявляются в нарушении пролиферации. У пациентов с миелодиспластическим синдромом/острым миелоидным лейкозом (МДС/ОМЛ) и мутацией в RUNX1, последние чаще всего наблюдаются в NRAS, FLT3, JAK2 и с-KIT генах.

2. Цели и задачи Цель: исследование роли точечных мутаций гена RUNX1 в патогенезе миелодиспластических и миелопролиферативных заболеваний у детей Задачи: 1. Определить группы пациентов детского возраста с миелодиспластическими и миелопролифера-тивными заболеваниями, в которых наиболее часто встречаются точечные мутации гена RUNX1 2. Охарактеризовать кооперативные пути лейкемогенеза у пациентов с точечными мутациями гена RUNX1

3. Объект и предмет исследований В исследование были включены 248 пациентов в возрасте от 1 до 18 лет с миелодиспластическим или миелопро- лиферативными заболеваниями за период с 1986 по 2009г. Исследования были одобрены комитетом ГУ РНПЦДОГ по этическим вопросам (протокол от февраля 2007г.) В исследование были включены 248 пациентов в возрасте от 1 до 18 лет с миелодиспластическим или миелопро- лиферативными заболеваниями за период с 1986 по 2009г. Исследования были одобрены комитетом ГУ РНПЦДОГ по этическим вопросам (протокол от февраля 2007г.)

Пациенты (248 человек) были разделены на шесть групп по их клиническим характеристикам: de novo ОМЛ – 204 человека de novo МДС – 20 человек вторичный ОМЛ после лечения опухоли – 6 человек вторичный ОМЛ после лечения АА – 3 человека ЮММЛ – 10 человек ХММЛ – 5 человек.

4. Научная гипотеза Поскольку до сих пор вся существующая информация была получена для взрослых пациентов, было принято решение исследовать случаи точечных мутаций гена RUNX1 в детских миелодиспластических и миелопролиферативных заболеваниях. Кроме того, была предпринята попытка охарактеризовать описанные ранее для взрослых пути кооперации мутаций в выбранной группе пациентов с мутациями в RUNX1. Поскольку до сих пор вся существующая информация была получена для взрослых пациентов, было принято решение исследовать случаи точечных мутаций гена RUNX1 в детских миелодиспластических и миелопролиферативных заболеваниях. Кроме того, была предпринята попытка охарактеризовать описанные ранее для взрослых пути кооперации мутаций в выбранной группе пациентов с мутациями в RUNX1.

5. Основные результаты В ходе проведенного нами исследования было показано, что частота мутаций гена RUNX1 в группе пациентов детского возраста с диагнозом первичный ОМЛ составила 3%, первичный МДС - 15%, вторичный ОМЛ – 33%. В ходе проведенного нами исследования было показано, что частота мутаций гена RUNX1 в группе пациентов детского возраста с диагнозом первичный ОМЛ составила 3%, первичный МДС - 15%, вторичный ОМЛ – 33%. В группе пациентов с индуцированными заболеваниями показана кооперация между мутациями в генах RUNX1, NRAS и хромосомной аберрацией -7/7q-, тогда как в группе с мутациями в гене RUNX1 и диагнозом первичный ОМЛ и МДС преобладают пациенты нормальным кариотипом в опухолевых клетках. В группе пациентов с индуцированными заболеваниями показана кооперация между мутациями в генах RUNX1, NRAS и хромосомной аберрацией -7/7q-, тогда как в группе с мутациями в гене RUNX1 и диагнозом первичный ОМЛ и МДС преобладают пациенты нормальным кариотипом в опухолевых клетках. В группе пациентов с диагнозом de novo и вторичный ОМЛ и МДС, характеризующихся нормальным кариотипом или аберрацией -7/7q-, необходимо проводить мутационный скрининг гена RUNX1, с целью поиска генетического маркера для эффективного отслеживания минимальной остаточной болезни в ходе лечения и на стадии ремиссии. В группе пациентов с диагнозом de novo и вторичный ОМЛ и МДС, характеризующихся нормальным кариотипом или аберрацией -7/7q-, необходимо проводить мутационный скрининг гена RUNX1, с целью поиска генетического маркера для эффективного отслеживания минимальной остаточной болезни в ходе лечения и на стадии ремиссии.

6. Научная новизна Впервые получена информация о роли точечных мутаций гена RunX1\AML1 в патогенезе миелодиспластических и миелопролиферативных заболеваний у детей. Впервые получена информация о роли точечных мутаций гена RunX1\AML1 в патогенезе миелодиспластических и миелопролиферативных заболеваний у детей. Охарактеризованы альтернативные пути кооперации мутаций у пациентов с МДС\ОМЛ. Охарактеризованы альтернативные пути кооперации мутаций у пациентов с МДС\ОМЛ.

7. Положения, выносимые на защиту 1. Наиболее часто точечные мутации гена RunX1\AML1 встречаются у пациентов с диагнозом «вторичный ОМЛ»; 2. В случаях индуцированного терапией ОМЛ показана кооперация между мутациями RunX1, NRas и хромосомной аберрацией -7/7q.

8. Конференции и публикации «66-я научная конференция студентов, магистрантов, аспирантов» 7 мая 2009г., г. Минск «66-я научная конференция студентов, магистрантов, аспирантов» 7 мая 2009г., г. Минск «67-я научная конференция студентов, магистрантов, аспирантов» 4 мая 2010г., г. Минск «67-я научная конференция студентов, магистрантов, аспирантов» 4 мая 2010г., г. Минск Мигас А.А., Савва Н.Н., Матвеева (Мишкова) О.А., Алейникова О.В. Мутации гена RUNX1 у пациентов детского и юношеского возраста с de novo и вторичными ОМЛ и МДС. Сборник статей "Патогенез социально значимых заболеваний человека"., стр Минск, БГМУ. Мигас А.А., Савва Н.Н., Матвеева (Мишкова) О.А., Алейникова О.В. Мутации гена RUNX1 у пациентов детского и юношеского возраста с de novo и вторичными ОМЛ и МДС. Сборник статей "Патогенез социально значимых заболеваний человека"., стр Минск, БГМУ.

9. Благодарности научному руководителю к.б.н. Гринёву В.В. научному руководителю к.б.н. Гринёву В.В. м.н.с. лаборатории молекулярно-генетических исследований ГУ РНПЦДОГ Мигасу А.А. м.н.с. лаборатории молекулярно-генетических исследований ГУ РНПЦДОГ Мигасу А.А. зам.директора ГУ РНПЦДОГ по науке Савве Н.П. зам.директора ГУ РНПЦДОГ по науке Савве Н.П. научной группе лаборатории молекулярно- генетических исследований ГУ РНПЦДОГ научной группе лаборатории молекулярно- генетических исследований ГУ РНПЦДОГ К.б.н., в.н.с. ГУ РНПЦДОГ Кустановичу А.М. К.б.н., в.н.с. ГУ РНПЦДОГ Кустановичу А.М.

Номер случаяДиагнозНуклеотидная заменаЭффектДомен De novo ОМЛ (204) 1ОМЛ M1g C>Tp. 20Ser>synRUNT 2ОМЛ M6g C>Ap.114Ser> StopRUNT 3ОМЛ M4g G>Ap.174Arg>GluRUNT 4ОМЛ M4g C>Gp.139Arg>GlyRUNT 5ОМЛ M1g T>G, g T>C, g _ ins26 p.62Leu>Arg; p.63Val>Ala; сдвиг рамки считывания RUNT 6ОМЛ M2g del 17Дерегуляция сплайсинга 7ОМЛ M2g G>Ap.53Val>synRUNT 8ОМЛ БДУg A>Gp.199Glu>synNRDBc 9ОМЛ M2g C>Tp.218Pro>LeuNRDBc De novo МДС (20) 10МДСg T>Cp.29Leu>TrpNRDBn/NRHn 11МДС (РАИБ)g C>Tp.187Thr>IleNRDBc 12МДС (РА)g T>Gp.124Met>ArgRUNT Вторичный ОМЛ после лечения первичной опухоли (6) 13вОМЛ M1g G>Cp.172Gly>AlaRUNT 14вОМЛ M2g del 17Дерегуляция сплайсинга Вторичный ОМЛ после лечения АА (3) 15вОМЛ M1g G>Tp.141Gly>StopRUNT Обнаруженные нуклеотидные замены у пациентов.

Доля случаев мутаций среди групп пациентов с соответствующими диагнозами

ДиагнозЦитогенетикаКоличество случаев de novo ОМЛ (6)без аберраций3 -7/7q2 t(6;14)1 de novo МДС (3)без аберраций2 -7/7q1 т-ОМЛ после лечения опухоли (2) без аберраций1 t(9;11)1 т-ОМЛ после лечения АА (1) без аберраций- -7/7q1 Особенности цитогенетических характеристик у пациентов с обнаруженным мутациями

Экспрессия генов b-actin и RUNX1 у пациентов с делециями и в контрольном образце дикого типа. Дорожки 1, 2 и 5, 6 представляют собой продукты амплификации кДНК генов b-actin и RUNX1 в образцах 6 и 14 соответственно. Дорожки 3, 4 и 7, 8 в контрольных образцах здоровых доноров. Дорожки 1, 2 и 5, 6 представляют собой продукты амплификации кДНК генов b-actin и RUNX1 в образцах 6 и 14 соответственно. Дорожки 3, 4 и 7, 8 в контрольных образцах здоровых доноров.

Анализ числа копий гена RUNX1 у пациентов с делецией в 17 пар оснований. Дорожки 1-3 представляют продукты ПЦР амплификации экзона 5 и части интрона 5-6 гена RUNX1 в случаях 6, 14 и для донора дикого типа соответственно. Расположенный выше фрагмент – продукт амплификации аллеля дикого типа. Нижний – продукт мутантного аллеля. Дорожки 4-6 демонстрируют ПЦР продукт амплификации фрагмента гена b-globin в таком же порядке. Дорожки 1-3 представляют продукты ПЦР амплификации экзона 5 и части интрона 5-6 гена RUNX1 в случаях 6, 14 и для донора дикого типа соответственно. Расположенный выше фрагмент – продукт амплификации аллеля дикого типа. Нижний – продукт мутантного аллеля. Дорожки 4-6 демонстрируют ПЦР продукт амплификации фрагмента гена b-globin в таком же порядке.

Распределение мутаций в исследуемой области g T>C g ins 26 g T>C g C>G Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6 Exon 7 Exon 8 g C>A g T>G g C>G g G>T g G>C g G>A g del 17 g C>T g C>T runt