ИММУНОЧИПЫ – НОВЫЙ ФОРМАТ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Чеканова Т.А., Маркелов М.Л., Пудова Л.А., Кирдяшкина Н.П., Гоптарь И.А., Судьина А.С., Андрюшина Т.А., Шипулин Г.А. ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора

Разработка тест-систем в формате иммуночипа для диагностики инфекционных, аллергических и аутоиммунных заболеваний Почему формат иммуночипа?

ИФА -+ - невозможно получить результаты по нескольким маркерам заболевания в одном анализе (различные протоколы, различные наборы), - высокая себестоимость для комплексной диагностики (несколько маркеров) - широко используется в клинической практике, - доступное оборудование, - разумная цена для единичного анализа Иммуночип ИФА vs

невозможно получить результаты по нескольким инфекциям за один анализ (различные наборы), - очень высокая цена анализа, - субъективная интерпретация результатов - широко распространен в клинической практике, - не нуждается в специализированном оборудовании Иммуноблот + Иммуночип VS Иммуноблот

+- Автоматическое процессирование Мультиплексность анализа (до 500 параметров) Очень дорогие тест- системы и оборудование Дорогое техническое обслуживание Технологии не для каждой лаборатории Evidence ( RANDOX ) BioPlex (BIO-RAD)

В основу современного алгоритма серологической диагностики заложена необходимость проведения повторного тестирования для верификации результатов анализа ИФА Повтор ИФА + Подтверждающий иммуноблоттинг +/-+/- Перетестирование через 3-6 месяцев Повтор подтверждающего иммуноблоттинга ind

+ = Иммуночип – одноэтапный тест для выявления большого числа значимых биологических маркеров заболеваний, - высокая информативность, - возможность сочетания скрининга и подтверждения в одном формате сопоставимый (или >) по чувствительности с ИФА, а по специфичности с иммуноблотом

Принципиальное отличие биочипов – возможность выявления в одном анализе множества маркеров 15 Цитокинов

Аллергочип ImmunoCAP ISAC IgE Общее время проведения реакции на чипе – около 5 часов Минимальное количество образца – 20 мкл на 103 аллергена Простота постановки

Новая технология бесконтактной микропечати с помощью современных наноплоттеров Позволяют печатать на слайды или дно лунок планшетов

1 чип (слайд) = 1 образец1 слайд = 16 образцов, 16 Х 4 = 64 образца 1 планшет = 96 образцов

Эррей – лунка планшета Флуоресцентный профиль эррея на альдегидном слайде Иммуносорбенты для планарных чипов высокой плотности – активированные микроскопные слайды и полистироловые планшеты

КАНАЛ Cy5 (антитела IgG) КАНАЛ Cy3 (антитела IgM) Детекция антител разных классов в одной постановке в одном эррее

Себестоимость анализа при использовании разных серологических методов Число анализируемых инфекций (количество маркеров на одну инфекцию = 5) руб ИФА + ИБ ИФА Иммуночип

Принципы размещения антигенов и антител на одном иммуночипе Микроорганизмы, имеющие перекрестно- реагирующие антигены Инфекции, вызываемые патогенными спирохетами Микроорганизмы, имеющие одинаковые пути передачи Трансфузион- ные инфекции Микроорганизмы, вызывающие сходную патологиюАФС, ToRCH- инфекции Микроорганизмы, эндемичные для региона, в котором планируется использовать иммуночип Арбовирусные инфекции

Схема проведения анализа с помощью иммуночипа Разведение сывороток Инкубация с образцом, 37 0 С Детекция Отмывка Инкубация c коньюгатом, 37 0 С

ТЕСТ-СИСТЕМЫ В ФОРМАТЕ ИММУНОЧИПОВ, РАЗРАБАТЫВАЕМЫЕ В ЦНИИЭ

р100 B.gar. р100 B.afz VlsE B.gar. VlsE B.afz p58 B.afz. p41 B.gar p41 B.afz маркер границы эррея р100 B.gar. р100 B.afz VlsE B.gar. VlsE B.afz p58 B.afz. p41 B.gar p41 B.afz маркер границы эррея p39 B.afz BBK32 B.gar BBK32 B.afz OspC B.afz p17 B.gar p17 B.afz маркер границы эррея p39 B.afz BBK32 B.gar BBK32 B.afz OspC B.afz p17 B.gar p17 B.afz маркер границы эррея Вспомогательные контроли (титрование IgG/IgM человека) маркер границы эррея Вспомогательные контроли в титровании (титрование IgG/IgM человека) маркер границы эррея Вспомогательные контроли в титровании (титрование анти- IgG/IgM человека) маркер границы эррея Вспомогательные контроли в титровании (титрование анти-IgG/IgM человека) маркер границы эррея + - Дизайн эррея иммуночипа для серодиагностики Лайм-боррелиоза

Чувствительность и специфичность иммуночипа для cеродиагностики ИКБ (клинический материал предоставлен и охарактеризован клиническими базами: МОНИКИ, НИИР РАМН, Центрами санэпиднадзора - г. Ижевск, г.Киров, г.Ярославль, г. С.-Петербург) IgMIgGIgM + IgG 1 стадия (n =159) 60,1 %48,6 %87,3 % стадии (n = 201) 55,7 %88,6 %97,1 % cпецифичность (n = 495) 96,4%97,2%

Сравнительное изучение выявления специфических антител в сыворотках крови больных ИКБ в различных тест-системах (процент выявления антител, ограниченная выборка клинического материала, n=42) %

образециммуночип (спектр антител) иммуноблот (количество баллов и спектр антител) VlsE B. afzelii, p41int B. afzelii, p17 B.afzelii - (4 балла) p41int B. afzelii, p41int B. garinii OspC B. garinii + (8 баллов) OspC OspC B. garinii, OspC B. afzelii + (8 баллов) OspC VlsE B. garinii, OspC B. garinii - (3 балла) VlsE p100 B. afzelii, p41 int B. afzelii, p39 B. afzelii, OspC B. garinii, p17 B. afzelii, p17 B. garinii + (11 баллов) VlsE, OspC p41 int B. afzelii, OspC B. afzelii, OspC B. garinii - (4 балла) p41 int B.afzelii, p41 int B. garinii p41 int B. afzelii, OspC B. afzelii, OspC B. garinii сомнительный (5 баллов) p41, p41 int B.afzelii, p41 int B. garinii Изучение дискордантных образцов в иммуноблоте на наличие антител класса М

C.burnetii Babesia Rickettsia F.tularensis Инфекции передаваемые клещами рода Ixodes

Иммуночип для выявления cпектра трепонемоспецифических и реагиновых антител классов G и M, ассоциированных с сифилисом Tp 47Tp 17Tp 47TmpAкардио липин К1К1К2К2 2,0616,14,843,451,5610,07,98 0,860,590,650,670, ,34

Результаты изучения чувствительности и специфичности иммуночипа для диагностики сифилиса Сыворотки Кол- во Кол-во полож. Кол-во отрицат. Кол-во н/о от пациентов с положительной реакцией на сифилис в рефер. т/с из панели МБС (полож.) из панели МБС (отриц.) 8-8- от больных Лайм- боррелиозом от больных лептоспирозом с высоким содержанием РФ-фактора от «здоровых» доноров

Иммуночип для серодиагностики TORCH-инфекций Одновременное выявление антител разных классов при использовании смеси конъюгатов (анти-IgG, - IgM, - IgA), меченых флуорофорами, отличающимися по спектральным характеристикам) Одновременное выявление антител к разным инфекциям на одном стекле 1 иммуночип на комплекс TORCH = 16 ИФА-тест-систем

Дизайн одного эррея для серологической диагностики TORCH-инфекций GRA1 (p24) T.gondii GRA7 (p29) T.gondii MIC3 T.gondii SAG 1 (p30) T. gondii E1 Rubella virus E2 Rubella virus core Rubella virus BSA- Cy5/Cy3 GRA1 (p24) T.gondii GRA7 (p29) T.gondii MIC3 T.gondii SAG 1 (p30) T. gondii E1 Rubella virus E2 Rubella virus core Rubella virus BSA- Cy5/Cy3 pp 28 CMV pp 38 CMV pp 52 CMV pp 65 CMV pp 150 CMV VP1 B19 Parvovirus VP2 B19 Parvovirus BSA- Cy5/Cy3 pp 28 CMV pp 38 CMV pp 52 CMV pp 65 CMV pp 150 CMV VP1 B19 Parvovirus VP2 B19 Parvovirus BSA- Cy5/Cy3 gD1 HSV-1 gG1 HSV-1 gD2 HSV-2 gG2 HSV-2 p18 EBV p54 (ENA) EBV EBNA EBV BSA- Cy5/Cy3 gD1 HSV-1 gG1 HSV-1 gD2 HSV-2 gG2 HSV-2 p18 EBV p54 (ENA) EBV EBNA EBV BSA- Cy5/Cy3 Внутренние контроли (human IgG/IgM) BSA- Cy5/Cy3 Внутренние контроли (human IgG/IgM) BSA- Cy5/Cy3 Внутренние контроли (anti - human IgG/IgM) BSA- Cy5/Cy3 Внутренние контроли (anti - human IgG/IgM) BSA- Cy5/Cy3 BSA- Cy5/Cy3 BSA- Cy5/Cy3 BSA- Cy5/Cy3 BSA- Cy5/Cy3 BSA- Cy5/Cy3 BSA- Cy5/Cy3 BSA- Cy5/Cy3 BSA- Cy5/Cy3

Флуоресцентная детекция спектра антител разных классов: IgG и IgM конъюгат анти-IgM человека-Сy3 + Канал Cy3Канал Сy

Совпадение результатов, полученных в иммуночипе, с данными ИФА при тестировании сывороток (всего- 700 шт) Комплекс ToRCH- инфекций % совпадения по положительным сывороткам по отрицательным сывороткам T.gondii97,6 CMV97,6100 HSV-1,297,697,7 Rubella94,397,5 EBV92,495,2

Определение значимых маркеров к ВИЧ 1 и 2 типов, ВГС, сифилису Канал внутреннего контроля - FITC Канал учета специфической реакции – Сy5 gp120, gp160, gp41, pol, gag, env(ВИЧ2), AТ p24, сore, NS3, NS4, NS5, Tp47, Tp17, Tp15, TmpA, IgG, анти-IgG, буфер

Оценка чувствительности иммуночипа «ВИЧ-ВГС-сифилис» (n = 1290 образцов) Исследуемые образцы Кол-воКол-во ВИЧ- положительных образцов Кол-во анти-ВГС- положительных образцов Кол-во образцов содержащих, антитела к сифилису - от больных сифилисом (5 – н/о) - ОСО ВИЧ-1(+) ОСО ВИЧ-2 (+) ОСО ВГС (1-16 +) от больных ВГС (8 – н/о) 22 - от ВИЧ- инфицирован- ных (4 – н/о) Чувствитель- ность, %

Оценка специфичности иммуночипа «ВИЧ-ВГС-сифилис» (n = 678 образцов) Исследуемые образцы Кол- во Кол-во ВИЧ- положительных образцов Кол-во анти-ВГС- положительных образцов Кол-во образцов содержащих, антитела к сифилису - от практически здоровых доноров ОСО ВИЧ ( - ) ОСО ВГС ( ) от лиц с аутоиммунными заболеваниями от инфекционных больных другой этиологии Специфичность, % 99,

Иммуночип для детекции ООИ ( B.anthracis, Y.pestis) для B.anthracis для детекции Y.pestis Аb SA26 Ab IgG F1 К - BSA-Cy5 К - (ФЦП «Национальная система химической и биологической безопасности РФ) Один эррей

Примеры флуоресцентных паттернов. Аналитическая чувствительность Y.pestis B. anthracis 10 3 cells/ml 10 7 cells/ml 10 4 cells/ml 10 5 cells/ml 10 6 cells/ml 10 3 cells/ml 10 4 cells/ml 10 5 cells/ml 10 6 cells/ml 10 7 cells/ml

ДНК-чип для детекции B.anthracis, Y.pestis, F.tularensis pagA Bacilus anthracis Yersinia pestis Francisella tularensis CapAcapB IglBCFopARD1mVin placaf1 caf2Ypo 0394 Ypo 0397 Printing buffer

Схема анализа с помощью ДНК-чипа Выделение ДНК из материала ПЦР-амплификация последовательность промотора T7-RNA полимеразы включена в структуру обратных праймеров последовательность промотора T7-RNA полимеразы включена в структуру обратных праймеров Транскрипция (15-30 мин) Гибридизация на DНК-чипе (30 мин) Детекция положительных сигналов на чипе с использованием стрепатавидин-Cy5 (15-20 мин) Детекция положительных сигналов на чипе с использованием стрепатавидин-Cy5 (15-20 мин) Сканирование и анализ результатов Сканирование и анализ результатов пробо-подготовка on-chipанализ

Примеры флуоресцентных паттернов после гибридизации на ДНК-чипе B.a. mix Y.p. mix F.t. mix B.a.+ Y.p + F.t. mix Штамм B. anthracis F.tularensis штамм Y.pestis антиген Праймеры Материал

Наши планы 1.Регистрация тест-систем для серодиагностики TORCH, cифилиса, трансфузионных инфекций, боррелиоза. 2.Разработка программы для обсчета результатов и формирования клинического отчета, удобного для врача- лаборанта. 3.Организация производства биочипов. 4.Взаимодействие с клиническими базами. 5 ……..

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!