Методы исследования в гистологии, цитологии и эмбриологии Часть II к.м.н., старший преподаватель М.Р. Гринева, д.м.н., профессор С.Ю. Виноградов д.м.н., профессор С.В. Диндяев Ивановская государственная медицинская академия Кафедра гистологии, эмбриологии и цитологии далее

Анализ гистологических препаратов оглавлениедалее

Оглавление Качественный анализ гистологических препаратов Обзорная микроскопия Техника микроскопирования Устройство светового микроскопа Интерпретация формы сечения объекта Пример 1 Пример 2 Интерпретация окрашивания тканей Базофилия Метахромазия Оксифилия Нейтрофилия Гисто- и иммуноцитохимические методы Примеры Метод радиоавтографии Количественный анализ гистологических препаратов Техническое оснащение морфометрических исследований Автоматизация морфометрических исследований Рекомендуемая литература далееназад

Качественный анализ гистологических препаратов оглавление Обзорная микроскопия Исследование химического состава клеток и тканей Исследование метаболизма клеток и тканей Цитохимические методы Гистохимические методы Иммунохимические методы Метод радиоавтографии Выявление распределения веществ, меченных радиоактивными изотопами ( 3 Н, 14 С, 32 Р и др.) в клетках и тканях Основаны на специфичности реакции между химическим реактивом (или антителом) и субстратом, находящимся в клетках и тканях далееназад

Обзорная микроскопия с помощью объективов различного увеличения оглавлениеназад Почка. Корковое вещество. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: х 56 (малое увеличение). Увеличение Почка. Корковое вещество. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: х 280 (большое увеличение). Увеличение Почка. Почечное тельце. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: х 630 (иммерсионное увеличение). Увеличение далее Используется для выявления общего плана строения органов, тканей, клеток.

Техника микроскопирования 1.Микроскопирование гистологического препарата начинают с установки правильного освещения. Для этого с помощью вогнутого зеркала, собирающего рассеянный пучок света, и конденсора достигают равномерного освещения поля зрения.вогнутого зеркалаконденсора 2.На предметный столик помещают гистологический препарат покровным стеклом вверх. 3.Изучение гистологического препарата начинают при малом увеличении (объектив х8), при этом расстояние между объективом и покровным стеклом должно быть около 1 см. Установку резкости проводят с помощью макровинта.малом увеличениимакровинта 4.Рассматривают детали гистологического препарата по всей площади, перемещая его на предметном столике. 5.Устанавливают в центр поля зрения участок гистологического препарата, который следует изучить при большом увеличении (объектив х40).большом увеличении 6.С помощью револьверного устройства ставят объектив с более сильным увеличением (х40). Установку резкости проводят с помощью микровинта.револьверного устройствамикровинта 7.Для изучения очень мелких гистологических структур используют иммерсионный объектив (х90).иммерсионный объектив На покровное стекло препарата наносят каплю иммерсионного масла. Осторожно опускают тубус до соприкосновения линзы объектива к маслу. Установку резкости проводят с помощью микровинта.микровинта После окончания работы иммерсионное масло удаляют с объектива и покровного стекла марлей. оглавлениеназад далее

Устройство светового микроскопа 1.Основание микроскопа 2.Тубусодержатель 3.Тубус 4.Окуляр (чаще ×7) 5.Револьвер микроскопа 6.Объективы а) сухие: ×8, ×20, ×40 б) иммерсионный ×90 7.Предметный столик 8.Конденсор 9.Макрометрический винт 10.Микрометрический винт 11.Винт конденсора 12.Зеркало Общее увеличение микроскопа = увеличение объектива × увеличение окуляра назадоглавление далее

Интерпретация формы сечения объекта Схемы срезов, сделанных в разных плоскостях через объекты различной формы (из Хэм А., Кормак Д. Гистология: в 5 томах; пер. с англ. – М.: Мир, 1982) : 1.Яйцо4. Объект, разделенный перегородками (апельсин)Яйцо 2.Прямые трубки5. Электрический кабель, состоящий из множестваПрямые трубки 3.Изогнутые трубки изолированных проводов оглавление далееназад

Интерпретация формы сечения объекта (пример 1) Спинной мозг. Мультиполярные нейроны. Увеличение х280. Толщина среза 6 мкм. Размеры клеток мкм. Микрофотография демонстрирует различные участки клеток, попавшие в срез: А – цитоплазма, ядро и ядрышко; Б – цитоплазма и ядро; В – только цитоплазма. оглавление А далее Б В назад

Интерпретация формы сечения объекта (пример 2) Почка. Корковое вещество. Увеличение: х Почечное тельце 2.Канальцевая системаа. продольные срезы b. поперечные срезы оглавлениедалее 1 2а 2 1 2b2b2b2b назад

Интерпретация окрашивания клеток и тканей оглавлениеназад Многослойный плоский ороговевающий эпителий. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: х56. Оксифилия Оксифилия поверхностных слоев Базофилия Базофилия глубоких слоев Метахромазия Метахромазия зернистости базофильного гранулоцита Оксифилия Оксифилия зернистости эозинофильного гранулоцита Нейтрофилия Нейтрофилия зернистости нейтрофильного гранулоцита Зернистые лейкоциты. Окраска по Романовскому-Гимзе. Увеличение: х630. далее

Базофилия Способность окрашиваться основными (щелочными) красителями называется базофилией (от греч. basis – основа и philia – любовь). Основные (щелочные) красители активно связываются со структурами, которые содержат кислоты и несут отрицательный заряд, например, ДНК, РНК. К ним, в частности, относятся гематоксилин, толуидиновый синий, тионин, метиленовый синий, азуры и др. Поэтому структуры, связывающие эти красители, называются базофильными. В клетке базофилией обладает ядро (вследствие высокого содержания ДНК и РНК), иногда цитоплазма (при высоком содержании в ней рибосом или гранулярной ЭПС). Базофильно может окрашиваться межклеточное вещество некоторых тканей – например, хрящевой. оглавление назаддалее

Метахромазия Метахромазия (от греч. meta – изменение и chroma – цвет, краска) – изменение цвета некоторых основных (щелочных) красителей при их связывании со структурами, обладающими специфическими химическими свойствами (обычно высокой концентрацией сульфатированных гликозаминогликанов). К таким красителям относятся толуидиновый синий, азур II, тионин и др. Способностью метахроматически окрашиваться обладают гранулы базофильных лейкоцитов, тучных клеток. Указанные красители окрашивают другие базофильные структуры в тех же тканях в обычный свойственный им цвет, т.е. ортохроматически (от греч. orthos – правильный и chroma – краска). оглавление далееназад

Оксифилия Способность окрашиваться кислыми красителями называется оксифилией, или ацидофилией (от греч. oxys или лат. acidus – кислый и греч. philia – любовь). Кислые красители связываются со структурами, имеющими положительный заряд – например, белки. К таким красителям относятся эозин, оранж G, эритрозин, пикриновая кислота и др. Структуры, связывающие эти красители, называются оксифильными или ацидофильными. Оксифилия свойственна цитоплазме клеток (особенно при высоком содержании в ней митохондрий и некоторых белковых секреторных гранул), эритроцитам (благодаря высокой концентрации в них гемоглобина). Оксифильно окрашивается цитоплазма кардиомиоцитов, мышечных волокон скелетной мускулатуры, некоторые компоненты межклеточного вещества (например, коллагеновые волокна). оглавление далееназад

Нейтрофилия Нейтрофилия (от лат. neutrum – ни тот, ни другой и philia - предрасположение, любовь) – способность гистологических структур окрашиваться и кислыми, и основными красителями. Способностью метахроматически окрашиваться обладают гранулы нейтрофильных лейкоцитов. оглавление далееназад

Гисто- и иммуноцитохимические методы назад В основе лежит применение химических реакций для выявления распределения химических веществ в структурах клеток, тканей и органов. Современные гистохимические методы позволяют обнаруживать аминокислоты, белки, нуклеиновые кислоты, различные виды углеводов, липидов и др.гистохимические методы Для выявления специфических белков используют иммуноцитохимические реакции. Для этого получают специфические сыворотки, содержащие антитела (например, против белка микротрубочек тубулина). Далее химическим путем соединяют эти антитела с флюорохромом (или другим маркером). При нанесении меченых антител на гистологический срез они вступают в соединение с соответствующими белками клетки и возникает специфическое свечение, видимое в люминесцентном микроскопе.иммуноцитохимические реакции Современные иммуноцитохимические методы, помимо флюорохромов, используют другие самые разнообразные специфические маркеры, позволяющие качественно и количественно оценивать содержание в клетке исследуемых соединений. оглавлениедалее b а Клетки печени 1а - включения липидов; 1b – включения гликогена; 2 – ядра Окраска по Бесту Окраска осмиевая кислота и сафранин

Гисто- и иммуноцитохимические методы (примеры) Цитоскелет эукариот (эндотелиальные клетки быка) Имунноцитохимический метод окрашивания Актиновые микрофиламенты окрашены в красный, микротрубочки в зеленый, ядра клеток в голубой цвет. назад.. Нуклеиновые кислоты в эпителии маточных желез Окраска акридиновым оранжевым Ядерная ДНК окрашена в зеленый цвет, РНК – в красный. Симпатические нервные сплетения Гистохимический метод Фалька Нейромедиаторы в нервных волокнах и клетках окрашены в зеленый цвет. оглавлениедалее

Метод радиоавтографии назад Радиоавтография - метод изучения распределения радиоактивных веществ в исследуемом объекте при наложении на объект чувствительной к радиоактивным излучениям фотоэмульсии. Введение в организм соединений, меченных радиоактивными изотопами, и дальнейшее исследование тканей и клеток позволяет получить точные данные о том, в каких именно клетках или клеточных структурах происходят те или иные процессы, локализуются те или иные вещества, установить временные параметры ряда процессов. Так, например, применение радиоактивного фосфора дало возможность обнаружить присутствие интенсивного обмена веществ в растущей кости; применение радиоактивных изотопов иода позволили уточнить закономерности деятельности щитовидной железы; введение меченых тритием предшественников нуклеиновых кислот помогли уяснить роль в обмене этих жизненно важных соединений определённых клеточных структур. Метод радиоавтографии позволяет определить не только локализацию радиоизотопа в биологическом объекте, но и его количество. оглавление Включение в ядра клеток соединительной ткани меченного тритием тимидина, идущего на построение нуклеиновых кислот. Увеличение х 600. далее

Количественный анализ гистологических препаратов оглавление Морфометрические методы Денситометрические методы Основаны на избирательном поглощении различными веществами лучей со строго определенной длиной волны. Интенсивность поглощения света зависит от концентрации вещества (оптической плотности структуры). Цитоспектро- фотометрия Цитоспектро- флюориметрия Планиметрия (на плоскости) Стереометрия (в объеме) Описывают метрические свойства морфологических структур в двух- и трехмерной системе, позволяют провести трехмерную реконструкцию объекта Статистические методы Позволяют установить характер связи между различными признаками, сравнивать объекты одного и разных организмов и т.д. далееназад

Техническое оснащение морфометрических исследований Количественный микроскопический анализ проводят на разных уровнях увеличения светового и электронного микроскопов. В качестве технического оснащения могут быть использованы винтовой окуляр- микрометр (1) и объект-микрометр (2), окулярные вставки (3) для планиметрии и стереометрии, измерительные окулярные линейки (3а), квадратно-сетчатые окулярные вставки (3b). оглавлениедалее назад1 3 3а 3b3b 2

Автоматизация морфометрических исследований В настоящее время для морфометрических исследований широко используются комплексы автоматизированной микроскопии, объединяющие работу микроскопа, цифровой камеры и компьютерного программного обеспечения в одну общую и простую систему для съемки и анализа изображений. Широта функций автоматических систем позволяет проводить статистическую обработку и анализ результатов измерений, а также моделирование различных процессов. оглавление назад далее

Рекомендуемая литература назад 1.Гистология, цитология и эмбриология: Учебник. / Под ред. Ю.А.Афанасьева, С.Л.Кузнецова, Н.А.Юриной. – М.: Медицина, – 768 с. 2.Гистология, эмбриология, цитология: Учебник. / Под ред. Э.Г.Улумбекова, Ю.А.Челышева. – М.: «ГЭОТАР-Медиа», – 408 с. 3.Жункейра Л.К., Карнейро Ж. Гистология: Атлас: Уч.пос.; пер. с англ., под ред. В.Л. Быкова. – М.: «ГЭОТАР-Медиа», – 576 с. 4.Хэм А., Кормак Д. Гистология: в 5 томах; пер. с англ. – М.: Мир, оглавление