Полиненасыщенные жирные кислоты как сигнальные молекулы Марина Глебовна С е р г е е в а Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Москва Семинар

Полиненасыщенные жирные кислоты как сигнальные молекулы 1. Липидомика и липидология 2. Арахидоновая кислота и другие полиеновые жирные кислоты как сигнальные липиды:синтез,окисл.метаболизм, мишени 3. Фосфолипаза А2 4. Ядерные рецепторы (PPARs) 5. Использование биоинформатики и подходов системной биологии для анализа воспалительных процессов на уровне клеток

Липидомика - системный анализ липидов и взаимодействующих с ними молекул (белки, нуклеиновые кислоты, глутатион и т.п.). Появление термина «липидомика»: [98] Han X, Gross RW. Global analyses of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples by ESI mass spectrometry: a bridge to lipidomics. J Lipid Res. 2003, 44(6):1071 Первая книга – 2005 г. (Feng L and Prestwich GD (eds) Functional Lipidomics (Dekker-CRC, New York, 2005) Появление термина «липидом»: [20] Kishimoto K, Urade R, Ogawa T, Moriyama T. Nondestructive quantification of neutral lipids by thin-layer chromatographyand laser-fluorescent scanning: suitable methods for "lipidome" analysis. Biochem Biophys Res Commun. 2001, 281(3):657 Существует около 1000 (4000) липидов; анализируют более 20 классов (около 95% от массы липидома) 1. Липидомика и липидология

Классическая парадигма: Парадигма постгеномной эры : 1. Липидомика и липидология Интерес к липидомике связан с: 1. Изменение общих подходов к изучению клеток

Диабет, изб.вес и др. - ядерные рецепторы (PPAR) Сердечно-сосудистые заболевания – простагландины и др. эйкозаноиды Пролиферация клеток, миграция, апоптоз - полиненасыщенные жирные кислоты, простагландины и др. эйкозаноиды NSAIDs (3-фосфоинозиды; церамиды; сфингозин-1 фосфат; лизофосфолипиды) Нейродегенеративные заболевания, шизофрения, депрессия полиненасыщенные жирные кислоты Астма – лейкотриены (lukasts + рак) 1. Липидомика и липидология Интерес к липидомике связан с: 2. Накоплением данных о нарушении метаболизма липидов при заболеваниях человека

1. Липидомика и липидология Интерес к липидомике связан с: 3. Созданием методов, позволяющих анализировать разнообразные липиды ESI/MS; LC/MS/MS Lipid arrays (ссылка)

Липидология Интерфазный катализ (sPLA2) Формирование мембран Липиды мембран как предшественники сигнальных молекул Липид-белковые взаимодействия «Липидно-аналитические работы» - диагностические цели Т.е. структурная и сигнальная липидомика 1. Липидомика и липидология

DNA – RNA белки метаболиты ответы геномика протеомика метаболомика липиды сахара токсины, etc Ткани и клетки Экстракты липидов Профиль липидов Ферменты, белки Управление системой липидомика 1. Липидомика и липидология Место липидомики среди других «-омик»

Ткани и клетки Экстракты липидов Профиль липидов Ферменты, белки построение системы Выделение липидов 2. Анализ липидов (ВЭЖХ, МС) 3. Анализ участвующих белков и пути 4. Создание системы 5. Прогнозирование действия системы 6. Разработка методов предсказания, диагностики, лечения Управление системой предсказаниедиагностикалечение Липидомика и липидология

n-7n-7 n-9n-9 пальмитоеновая 16:1 7 олеиновая 18:1 9 n-3n-3 n-6n-6 докозагексаеновая 22:6 3 рыба арахидоновая 20:4 6 мясо, яйца Сердечно-сосудистые заболевания, воспаление, травмы мозга психозы, шизофрения, нейродегенеративные заболевания 2. Арахидоновая кислота и другие полиеновые жирные кислоты как сигнальные молекулы

n-6 Линолевая (18:2n-6) -Линоленовая (18:3n-6) Дигомо- - линоленовая (18:3n-6) Арахидоновая (20:4n-6) Докозатетраеновая (22:4n-6) Докозапентаеновая (22:5n-6) n-3 -Линоленовая (18:3n-3) Стеаридоновая (18:4n-3) Эйкозатетраеновая (20:4n-3) Эйкозапентаеновая (20:5n-3) Докозагексаеновая (22:6n-3) 6 -десатурация элонгация 5 -десатурация элонгация диета Тромбоциты: [АA]о = 5 мМ 1% - 50 М (св) Лейкоциты: 0,1-1 М (св) Островки Лангерганса: 15 М (св) [АA]внекл = 1-10 М DHA~50% клетки мозга Синтез ненасыщенных жирных кислот

2. Арахидоновая кислота и другие полиеновые жирные кислоты как сигнальные молекулы Молекулярная эволюция элонгаз и десатураз человека

1) сигнал проводится через классические G-белок связывающие рецепторы плазматических мембран; 2) сигнал проводится через различные внутриклеточные мишени: а) глутатион; б) белки-участники проведения внутриклеточных сигналов (например, модуляция арахидоновой кислотой активности протеинкиназы С); в) G-белок связывающие рецепторы, локализованные на ядерных мембранах; г) факторы транскрипции, которые связываются с нуклеиновыми кислотами и регулируют экспрессию клеточных белков. 2. Арахидоновая кислота и другие полиеновые жирные кислоты как сигнальные молекулы Сигнальные эффекты липидных медиаторов

Арахидоновая кислота и другие полиеновые жирные кислоты как сигнальные молекулы COOH PGH-синтаза (циклооксигеназа) PGH 2 PG синтазы TxA 2 PGI 2 PGE 2 PGF 2 PGD 2 Агрегация тромбоцитов и др. эффекты NSAIDs С 1978 г. С.Д. Варфоломеев, А.Т. Мевх, Г.Ф. Судьина, П.В. Вржещ и др.

2. Арахидоновая кислота и другие полиеновые жирные кислоты как сигнальные молекулы COOH PGH-синтаза, циклооксигеназа PGH 2 PG синтазы TxA 2 PGI 2 PGE 2 PGF 2 PGD 2 5-липоксигеназа 5-HPETE лейкотриены Г.Ф. Судьина и др. С.Д. Варфоломеев, А.Т. Мевх, П.В. Вржещ и др.

2. Арахидоновая кислота и другие полиеновые жирные кислоты как сигнальные молекулы 4 5o5o Просвет сосуда Альвеолы легких 6 4MN 5o а б PGI 2 TxA 2 5-HETE 12-HETE 4 в г AA LTB 4 LTC 4 PGE 2 Физическое воздействие, Тромбин, TNF АФК, IL-1 5 PGE 2 IL-1 д PGA 2 EET LxA 4 HXs Место воспаления PGA 2 EETs LxA 4 HXs AA 12/15HETE PGE 2 IL-1 IL-6 IL-8 oxLDL AA Участие компонентов каскада арахидоновой кислоты в регуляции воспалительного процесса в легких

2. Арахидоновая кислота и другие полиеновые жирные кислоты как сигнальные молекулы COOH PGH-синтаза, циклооксигеназа PGH 2 PG синтазы TxA 2 PGI 2 PGE 2 PGF 2 PGD 2 PGA 2 15d-PGJ 2 5-липоксигеназа 5-HPETE лейкотриены Ремоделинг, Фосфолипаза А2 Прямые эффекты

2. Арахидоновая кислота и другие полиеновые жирные кислоты как сигнальные молекулы COOH PGH-синтаза, циклооксигеназа PGH 2 PG синтазы TxA 2 PGI 2 PGE 2 PGF 2 PGD 2 PGA 2 15d-PGJ 2 5-липоксигеназа 5-HPETE лейкотриены EETs, HETEs cytP450 12/15 LO HXs,LXs, HETEs Ремоделинг, Фосфолипаза А2 Прямые эффекты н/о мет. Этаноламиды и др.

2. Арахидоновая кислота и другие полиеновые жирные кислоты как сигнальные молекулы Эндогенная АК (из внутриклеточных пулов) - субстрат PGH-синтазы; Экзогенная АК - регулятор синтеза простаноидов. 5 M A23187; 10 M АК Gonchar M. et al. (1999) Eur. J. Biochem. 265(2):779 Источники арахидоновой кислоты (АК) при синтезе простаноидов макрофагами

2. Арахидоновая кислота и другие полиеновые жирные кислоты как сигнальные молекулы Новое равновесие в клетках при микромолярных концентрациях арахидоновой кислоты во внеклеточной жидкости Strokin et.al. (2001) Biochemistry (Mosc) 66(3):312

2. Арахидоновая кислота и другие полиеновые жирные кислоты как сигнальные молекулы Экзогенная арахидоновая кислота как регулятор клеточных функций как меняется чувствительность клеток к провоспалительным веществам в присутствии экзогенной арахидоновой кислоты (1-10 М) ? как арахидоновая кислота влияет на метаболизм внутриклеточной арахидоновой кислоты и синтез простагландинов ? как взаимосвязаны арахидоновая, докозагексаеновая и другие полиеновые жирные кислоты в регуляции функций клеток ? как арахидоновая кислота влияет на [Ca 2+ ] i в клетках ?

АСТРОЦИТЫ – удобная модель: 2. Арахидоновая кислота и другие полиеновые жирные кислоты как сигнальные молекулы имеют рецепторы к нейротрансмиттерам (гистамин, аденозин, АТФ, ацетилхолин и др); синтезируют при активации TNF-, интерлейкины, АТФ и др.; синтезируют 20:4n-6 и 22:6n-3 кислоты, простагландины; физиологические концентрации агонистов вызывают осцилляции [Ca 2+ ] i ; блокада осцилляций разобщает связь между клетками Астроциты как активные партнеры во взаимосвязи с нейронами и эндотелиальными клетками сосудов 2. Арахидоновая кислота и другие полиеновые жирные кислоты как сигнальные молекулы

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: Сравнить специфичность действия внеклеточных кислот (20:4n-6, 20:5n-3, 22:6n-3) на [Ca 2+ ] i в астроцитах Пути появления Ca2+ в цитоплазме клеток при активации рецепторов Регуляция концентрации внутриклеточного кальция в астроцитах

2. Арахидоновая кислота и другие полиеновые жирные кислоты как сигнальные молекулы Ratio F340nm/F380nm Time (s) Экзогенная арахидоновая кислота: блокирует осцилляции [Ca 2+ ] i ; AA=DHA=EPA астроциты Sergeeva M. et al (2003) Cell Calcium. 33(4)283

2. Арахидоновая кислота и другие полиеновые жирные кислоты как сигнальные молекулы Первичный ответ на действие агониста (амплитуда ответа ) снижается + Ca 2+ 25% AA = DHA, 0% EPA - Ca 2+ 25% AA = DHA, 0% EPA Содержание Ca 2+ в депо (амплитуда) снижается 55% AA, 40% DHA, 0% EPA Депо-зависимый вход Ca 2+ (амплитуда) снижается Агонист: 65% AA, 45% DHA, 0% EPA SERCA ингибиторы: 50% AA, 50% DHA, 30% EPA Sergeeva M, et al. (2002) J Neurochem. 82(5):1252 Влияние ПЖК на вход кальция

2. Арахидоновая кислота и другие полиеновые жирные кислоты как сигнальные молекулы + Ca 2+ [Ca 2+ ] i =150 nМ AA=DHA [Ca 2+ ] i = 60 nM EPA - Ca 2+ не влияют УСТАНОВЛЕНИЕ НОВОГО УРОВНЯ [Ca 2+ ] i снижает чувствительность клеток к дальнейшему стимулированию AA=DHA>EPA

2. Арахидоновая кислота и другие полиеновые жирные кислоты как сигнальные молекулы Ответ на стимул – подъем Ca 2+ ( nM ) Ca 2+ -зависимые процессы Высвобождение ПНЖК Базальный уровень Ca 2+ ( nM ) Умеренный подъем Ca 2+ ( nM) Стимул ПЖК ПРИНИМАЮТ УЧАСТИЕ В УСТАНОВЛЕНИИ НОВОГО УРОВНЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО КАЛЬЦИЯ В АСТРОЦИТАХ – НЕЙРОПРОТЕКТОРНАЯ ФУНКЦИЯ Как меняется система регуляции внутриклеточного кальция при воспалениях?

2. Арахидоновая кислота и другие полиеновые жирные кислоты как сигнальные молекулы Экзогенные 20:4n-6 (АА) и 22:6n-3 (DHA) кислоты высвобождают эндогенную АА - положительная регуляция; Эндогенная АА ингибирует агонист-стимулированный подъем [Ca 2+ ] i на стадиях входа кальция и его высвобождения из депо - отрицательная регуляция. Регуляция ПЖК внутриклеточного кальция в астроцитах

2. Арахидоновая кислота и другие полиеновые жирные кислоты как сигнальные молекулы Экзогенная арахидоновая кислота (АК) как регулятор клеточных функций меняется чувствительность клеток к провоспалительным веществам в присутствии экзогенных кислот ДГК (22:6n-3), АК (1-10 М) - снижается; арахидоновая кислота влияет на [Ca 2+ ] i в астроцитах – нейропротекторная функция АК и ДГК; экзогенная АК влияет на метаболизм внутриклеточной АК и синтез простагландинов – активирует через высвобождение эндогенной АК, ДГК стимулирует высвобождение АК

3. Фосфолипаза А2

Высвобождение арахидоновой и докозагексаеновой кислот регулируются cPLA2 и iPLA2 Strokin M, Sergeeva M, Reiser G. (2003) Br J Pharmacol. 139(5):1014 Какая фосфолипаза отвечает за высвобождение эндогенных ПЖК

3. Фосфолипаза А2 Экзогенная и эндогенная докозагексаеновая кислота ингибирует синтез простаноидов

3. Фосфолипаза А2 cPLA 2 AA DHA iPLA 2 (VIB) COX-1/2 PG Transmitters Inflammatory mediators 1) 2) Новая функция iPLA2 (VIB) – регуляция синтеза простаноидов Как независимо регулировать активацию cPLA 2 и iPLA 2 ? Какие изменения в активности ферментов происходят при патофизиологических процессах в мозге?

4. Ядерные рецепторы (PPARs)

PPARs – лиганд-чувствительные факторы транскрипции суперсемейства ядерных рецепторов. Известно : α, β/δ, and γ PPARs может образовывать гетеродимеры с рецепторами ретиноидной кислоты (RXRs), связываться с «PP-response elements» (PPRE) и регулировать транскрипцию различных генов (преимущественно активация) PPARγ человека экспрессируется в адипоцитах, а также селезенка, мозг, печень, скелетные мышцы и др. Природные и синтетические агонисты PPARγ регулируют дифференцировку адипоцитов, гомеостаз глюкозы, воспалительные ответы Свойства PPAR

Структуры лигандов PPAR 4. Ядерные рецепторы (PPARs)

Nuclear Hormone Receptor Superfamily Steroid familyNon-steroid family ER, GR TR, RAR, PPAR, VDR RXR, PR AR Type I family Type II family CAR, SXR/PXR MR LXR,, FXR A/BCDE/F DBD Helix 12 AF1 LBD - AF2

Структуры лигандов ядерных рецепторов 4. Ядерные рецепторы (PPARs)

5. Использование биоинформатики и подходов системной биологии для анализа воспалительных процессов на уровне клеток Специализация: Молекулярная и клеточная биология липидов, биоинформатика, липидомика. Задачи: Анализ воспалительного процесса на уровне клетки экспериментальными методами: 1) исследование изменений спектра липидных сигнальных молекул в процессе эволюции у разных организмов; 2) анализ механизмов регуляции на уровне транскрипции и посттрансляционном уровне циклооксигеназ и фосфолипаз класса А2; 3) исследование PPAR, ядерного рецептора, который является ключевым липидным сенсором у млекопитающих Группа системной биологии липидов

5. Использование биоинформатики и подходов системной биологии для анализа воспалительных процессов на уровне клеток Задачи (продолжение): Компьютерный анализ систем регуляторных липидов: 1) анализ экспериментальных данных микроэррей, получаемых из разных баз данных; 2) поиск функциональных кластеров генов с использованием подходов липидомики и транскриптомики; 3) предсказание новых мишеней для сигнальных липидов и структуры новых липидподобных синтетических соединений для этих мишеней; 4) развитие подходов "-омик" для изучения системных заболеваний с нарушениями в системах сигнальных липидов; 5) развитие новых подходов для выделения модулей в сигнальных липидных каскадах с использованием методов биоинформатики. Группа системной биологии липидов

Использование методов биоинформатики Разделение метаболического пути на функциональные модули экспериментальная проверка Этап 1 Этап 3 Этап 4 Этап 2 Общая схема подхода Литература второго типа Литература третьего типа Литература четвертого типа Построение метаболического пути Литература первого типа

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Ю.Каратассо С.Д.Варфоломеев М.Г. Сергеева А.Т. Мевх С.А. Грабеклис Университет Отто-фон-Герике Магдебург, Германия Георг Райзер Михаил Строкин Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского - Факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва С.Е. Алёшин Н.В. Толмачёва А.Е. Ивлиев Группа системной биологии липидов Центр по химии лекарственных средств – ВНИХФИ В.В. Чистяков