Трансгенная мышь с геном гормона роста

Как определить экспрессию гена 1.Найти мРНК данного гена с помощью молекулярного зонда 2.Обнаружить белок с помощью АТ 3.Выделить тотальную мРНК, получить кДНК и с помощью зонда найти кДНК данного гена

Регуляция экспрессии генов на разных уровнях

1 уровень регуляции активности генов Это формирование активно транскрибируемого эухроматина и молчащего, компактизованного гетерохроматина Гетерохроматин подразделяется на конститутивный и факультативный Конститутивный – в цетромерах, теломерах, интеркалярный. Наполнен повторяющимися последовательностями и мобильными элементами Метилирование лизина по положению 9 в гистоне Н3 – подавление транскрипции

Роль модификации и ремоделирования нуклеосом в регуляции генетических процессов Нуклеосома – октамер гистонов с намотанной ДНК в 146 п.н.Имеет кор и хвосты гистонов Модификация нуклеосом включает – Ремоделирование Ковалентная модификация гистонов Замена гистонов

Модификация гистонов В регуляции активности генов

Нуклеосома – это октамер гистонов и 1,7 витка суперспирали фрагмента ДНК длиной 146 пар оснований В целом нуклеосомная упаковка ограничивает узнавание последовательности ДНК факторами транскрипции, репликации и рекомбинации По отдельным генам нуклеосомы распределяются неслучайным образом - позиционирование Позиционирование нуклеосом на промоторе может быть фактором регуляции транскрипции, как +, так и -

Ремоделирование нуклеосом – это изменение их связывания с ДНК. Осуществляют белки Перемещение нуклеосом Изменение расстояния между нуклеосомами Удаление гистонов Сборка гистонов

Ковалентная модификация включает – Ацетилирование – деацетилирование Фосфорилирование – дефосфорилирование Метилирование убиквитирование Метилирование лизина по положению 9 в гистоне Н3 – подавление транскрипции, часто это сочетается с метилированием ДНК по цитозину Ацетилирование лизина по положению 9 в гистоне Н3 в сочетании с метилированием лизина в положении 4– подавление транскрипции

Гистоновый код- 1.Аминокислотный остаток – разные АМК могут Подвергаться модификации – Лиз, Арг, Сер, Тре 2. Модифицирующие ферменты – их много 3. Белки, воспринимающие модификацию гистонов Комбинация всех этих факторов – и есть гистоновый код Обеспечивают активацию и сайленсинг генов, очевидно помогая факторам транскрипции

Регуляция изменением количества генов и структуры ДНК Утрата генетического материала –диминуция хроматина, разрушение ядра у эритроцитов Амплификация генов – Р-гликопротеина, рРНК Реаранжировка генных сегментов А) в генах И Б) у сальмонеллы инверсия промотора обусловливает разные типы флагеллина и обеспечивает ускользание от И.О. Роль транспозонов в регуляции активности генов. Эу- и гетерохроматин. Двойная спираль может принимать разные формы Инактивация Х-хромосомы Роль метилирования ДНК в регуляции экспрессии генов

Активный хроматин – эухроматин Нуклеосомная упаковка изменена или отсутствует Длинные участки, чувствительные к ДНК-азе 1, указывающие на возможность транскрипции Гиперчувствительные сайты к ДНК-азе 1, ассоциированные с энхансерными элементами у начала гена Более слабая упаковка ДНК под электронным микроскопом В политенных хромосомах – это пуфы

Метилирование ДНК Открыто еще до открытия Уотсона и Крика, но до сих пор остается много интригующих загадок Метилируется цитозин в 5 положении и аденин в 6 положении 1.Регуляция транскрипции 2.Клеточная дифференцировка и эмбриональное развитие 3.Геномный импринтинг 4.Инактивация мобильных элементов 5.Канцерогенез 6.Генетические заболевания человека 7.Замалчивание генов

Загадки- Отсутствует у дрозофилы и др. Обеспечивает накопление мутаций

У Dr дрожжейи C.elegans метилирования нет. Нарушение метилирования у человека приводит к остановке эмбрионального развития. Метилирование запрещено в сайтах старта транскрипции почти половины генов человека. метилирование связано с гетерохроматином При раке метилирование понижено, что приводит к геномной нестабильности, может и наоборот – повышение метилирования генов –супрессоров Метилтрансфераза в соответствии с матрицей метилирует сайт на дочерней нити ДНК. Как узнает ???

Неактивный хроматин – гетерохроматин Конститутивный - центромера, теломера, интеркалярный Факультативный - при гаметогенезе в Х-хромосоме гетерохроматин превращается в эухроматин

Транспозоны имеют рег элементы Транспозоны ограничены инвертированными повторами. При вырезании Т они сближаются и точно отрезаются от основной ДНК. Затем транспозаза делает разрез в новом месте, куда внедряется Т по типу «вырезание- встраивание» Ретротранспозоны – ограничены длинными концевыми повторамираспространяются с пом обр транскрипции с использованием закодированной в них интегразы 1.Нарушают работу гена 2.Вызывают мутации 3.Меняют регуляцию гена

Величина генома может бстро увеличиваться за счет распространения транспозонов 4 хр-ма Др. буквально набита Т У-хр-ма человека, Х хр-ма, 21 и 22 содержат много Т Сайт-специфические ретроТ- это те, которые внедряются только в определенном месте. Например Het.Nart, у Др отвечают за целостность теломер Р-элемент Др внедряется в 5 регулир область БТШ 70 Т могут одомашниваться, т.е. выполнять функцию промотора, инсулятора и т.д.

Регуляция на уровне репликации – В ядрышках ооцитов образуются экстрахромосомные копии генов рРНК. Этим достигается усиление синтеза рибосом

Регуляция генной активности на уровне транскрипции Регуляция транскрипции у прокариот( лактозный оперон) Позиционирование нуклеосом Регуляция транскрипции гормонами- один гормон, например ГК, может регулировать несколько ГК зависимых генов. ГК связывается с R – это и есть фактор транскрипции Транскрипция с разных промоторов (альтернативные промоторы) Базальный транскрипционный комплекс Факторы транскрипции. Локусконтролирующие районы РНК-интерференция Транскприпционная синергия Рибопереключатели – аптамеры, например соединенные с глицином. Когда его много, они включают гены для использования его как источник энергии

Структура факторов транскрипции ДНК-связывающий домен Домены активации транскрипции Антирепрессорные домены Домены, связывающие лиганды Лиганды-индукторы –гормоны, ретиноевая кислота, гормон щитовидной железы и лиганды –репрессоры- конечные продукты метаболических путей

Типы факторов транскрипции

Факторы транскрипции – главные регуляторы генной активности

Транскрипция с разных промоторов В гене коллагена 43 экзона и 2 промотора варианты транскрипции приводят к образованию 3 изоформ белка – 1 короткой и 2 длинных. Дисбаланс изоформ приводит к патологии сетчатки глаза Фрагмент С-концевого участка коллагена – эндостатин содержит 2 дисульфидные связи ( 183 АМК) Рецептор пролактина имеет 3 промотора, обладающих разн тканеспецифичностью

Регуляция экспрессии генов у прокариот – на примере лактозного оперона

В lac-опероне оператор перекрывает промотор и 5-конец 1 структурного гена

Метаболизм лактозы

При отсутствии в среде лактозы белок-репрессор связывается с оператором и препятствует соединению РНК-полимеразы с промотором и отменяет транскрипцию 3-х генов.

При появлении лактозы репрессор связывается с ней, а не с оператором, транскрипция идет

Инсулятор блокирует действие энхансера, если инсулятор находится между энхансером и промотором

Активация транскрипции за счет связывания сap и сAMP

Регуляция транскрипции транспозонами (Т) Поскольку Т несут в своем составе регуляторные сигналы для Тр, (промоторы, энхансеры, сайленсеры, инсуляторы)то перемещение этих сигналов по хромосоме может изменять Тр смежных с ними генов После удаления Т его промотор может остаться на месте ретроТ внедряются чаще в регуляторные районы генов. При этом ген-хозяин не портится и терпит Т Брешь после удаления Т может залечиваться с ошибками, т. е. остается след после Т в виде мутации

Т может изменить границы петель. Некоторые Т могут нести последовательности инсулятора, с которым связываются белки. Например, у gypsy последовательность инсулятора повторена 12 раз Т могут участвовать в перестройках хромосом. Например, mariner обеспечивает неравный кроссинговер и делецию в 17 хромосоме, что проявляется в нейродегенеративных заболеваниях и повышении уровня холестерина

Эукариотические мРНК довольно стабильны (часы и сутки)До выхода в цитоплазму они проходят процессинг. Поэтому часто регуляция на уровне транскрипции не возможна. Возрастает важность следующего уровня

Посттранскрипционный уровень регуляции генной активности Транспорт мРНК из ядра Процессинг мРНК Альтернативный сплайсинг Редактирование мРНК ( Аро-В в печени 4563 АМК, в кишечнике – В АМК, за счет изменения в 2153 САА на UAA т.е. образование стоп-кодона Альтернативные сайты полиаденилирования обеспечивают разную силу матрицы

Альтернативный сплайсинг как регулятор активности генов

Редактирование РНК – термин предложен Р. Бенни для феномена встраивания 4 У. В митохондриальный транскрипт одной из субъединиц цитохромоксидазы трипаносомы brucei. Это исправляет закодированный в ДНК сдвиг рамки Считывания и приводит к синтезу функц. белка Процесс осущ-ся гидовой РНК. Редактируемый комплекс наз. Эдитосома У млекопит. обнаружено тканеспец. Редактирование мРНК аполипопротеина В путем дезаминирования С –U и модификацию А-Т в гене рецептора глутамата

Биологические последствия редактирования РНК Образование пригодной для трансляции РНК И редактированная и нередактированная РНК могут быть матрицами для трансляции белков, различающихся по функции Позволяет синтезировать 2 тРНк с одного гена ( в митохондриях животных) Может сделать мРНК более стабильной Т.О. – это механизм регуляции генной активности

Регуляция генной активности на уровне трансляции Инициация трансляции с альтернативных сайтов Регуляция активности матрицы. Очень активные мРНК у вирусов и фагов, у мажорных белков Регуляция полужизни матрицы ( ген глобина 10 часов. гены факторов роста менее 1 часа, гены гистонов в S- периоде – несколько часов, в G2 –периоде – минут) Изменение стабильности мРНК Роль 5 и 3 НТО в регуляции трансляции ( регуляция синтеза ферритина) Изменение скорости трансляции Альтернативные сайты терминации трансляции Зависимость от контекста. Так, селеноцистеин кодируется стоп-кодоном UGA если за ним определенный контекст. Контекст называют вторым генетическим кодом

Регуляция синтеза ферритина если железа в среде мало, то соответствующая мРНК не транслируется.Ингибирование происходит на стадии инициации белком, который имеет сродство к ионам железа и связываясь с ним отваливается от ферритиновой мРНК. Вновь синтезированный ферритин отнимает железо от репрессора, который опять приобретает сродство к ферритиновой мРНК и останавливает синтез ферритина. Сюрприз в том, что репрессор – это известный фермент цикла Кребса- аконитаза

Дискриминация мРНК- инициирующие участки РНК имеют разное сродство к рибосомам и поэтому с разной эффективностью связывают их. Поэтому существуют сильные и слабые матрицы. Это определяется факторами инициации, которые локализуются на инициирующих субъединицах рибосом, зависит от контекста в районе AUG, шпилек и удлинения 5НТО, декепирования мРНК Нормальная трансляция зависит от положения мРНК в клетке. Так, в ооцитах Dr мРНК генов oskar и nanos для трансляции должна занять место на переднем конце яйца, а для гена bicoid –на заднем. Это обеспечивается связыванием с тубулином и актиновыми филаментами

Трансляционная репрессия – белок репрессор связывается с участком инициации трансляции и препятствует связыванию инициирующей рибосомы. Часто репрессором служит продукт данной РНК (ферритин)

Маскирование мРНК – осуществляется белком связывающимся с 3 НТО. Как связывание с хвостом затыкает рот всей мРНК? Очевидно за счет изменения конформации молекулы. Макирование и демаскирование мРНК – это прием быстрого регулирования синтеза РНК у эукариот

Рнк не выходит из ядра, пока не закончится ее процессинг. У ВИЧ есть регулируемый ядерный транспорт. Он заключается в том, что после транскрипции его РНК, клеточный механизм не может их выпустить из ядра, но у вируса на этот случай имеется ген Rev, облегчающий выход непроцессированных вирусных РНк в цитоплазму для дальнейшей трансляции 6. Белки, связываясь с 3НТО и 5НТО подавляют трансляцию 7. Фосфорилирование инициирующих факторов регулирует синтез белка 7. Подавление трансляции ми РНК

Посттрансляционный уровень регуляции Фолдинг белка Роль гликозилирования, фосфорилирование, ацетилирование и др и др. модификации белка Удаление частей полипептида (интеинов, сигнальной последовательности) Феномен прионизации белка

Механизмы сайленсинга Гипотеза гистонового кода – ковалентные модификации ДНК и гистонов гипоацетилирование, убиквитирование и фосфорилирование гистонов Метилирование гистонов и ДНК В результате образуются участки компактизации хроматина, не способные к транскрипции На цитологическом уровне сайленсеры – это участки гетерохроматина

Особенности регуляции генной активности у эукариот Отсутствие единой рег. системыМоноцистронный принцип Комбинационный характер регуляции – у одного гена много генов – регуляторов. У разных генов –пере- крывающиеся наборы генов Плейотропный эффект генов-регуляторов Преобладание позитивной, а не негативной Регуляции Специфическая регуляция гормонами Участие компактизации хроматина Регуляция на всех уровнях от ДНК до продукта и после