7. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ДИКИХ И ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ ВИРУСА КОРИ Высокая частота мутаций, типичная для РНК-содержащих вирусов и обусловленная главным образом ошибками вирусспецифической полимеразы и отсутствием репарационных систем, ведет к появлению популяционной структуры, состоящей из большого числа микровариантов.

Попытка определения спонтанной частоты мутаций у вируса кори была предпринята С. Шраг с сотр. (Schrag et al., 1999). В задачу исследования входило изучение частоты мутаций в Н-гене, влияющих на конформацию эпитопа, взаимодействующего с моноклональным антителом Mab 80-III-B2. При этом был использован флюктуационный тест, разработанный Луриа и Дельбрюком (Luria and Delbruck, 1943).

В течение последних десятилетий накопились факты, свидетельствующие о наличии вариабельности биологических свойств среди диких и вакцинных штаммов вируса кори. В частности, хотя вирус кори рассматривается как относительно стабильный в антигенном отношении вирус (монотипический вирус), имеются сообщения о наличии заметных антигенных вариаций, определяемых с помощью моноклональных антител (Sheshberadaran and Norby, 1986; Tamin et al., ).

Были описаны варианты вируса кори, которые агглютинируют эритроциты только в присутствии высоких концентраций ( 0,8 M) сульфата аммония. Некоторые коревые изоляты неожиданно оказались такими солезависимыми вариантами (Gould et al.,1976; Shirodaria et al., 1976). Молекулярный механизм этого феномена остается неясным, однако результаты исследований д-ра Фланагана и д-ра Римы ( Flanagan and Rima неопубликованные данные) показывают, что у соле зависимых вариантов имеются в Н-белке аминокислотное замещение F- L в позиции 117.

Особого внимания, заслуживает антигенная вариабельность вируса кори. Чтобы оценить потенциальные иммунологические последствия наблюдаемых изменений поверхностных гликопротеинов диких штаммов вируса кори, циркулирующих в настоящее время в природе, были детально исследованы образцы сывороток от вакцинированных лиц и коревых больных (Tamin et al., 1994).

Попытки картировать эпитопы на поверхности Н- белка с использованием синтетических пептидов в большинстве своем оказались безуспешными. Только антисыворотка к пептидам, соответствующим последовательности аминокислот , которая консервативна у всех диких штаммов, исследованных до настоящего времени, обнаруживала нейтрализующую активность.

Таким образом, роль антигенных изменений Н-белка в эпидемиологии коревых инфекций до сих пор остается неясной. Существующие в настоящее время дикие штаммы вируса кори хорошо нейтрализуются антителами, индуцируемыми вакцинными штаммами, и эти вакцинные штаммы весьма эффективны в предотвращении заболеваний. Возможно, однако, что антигенные изменения в Н – белке диких штаммов вируса кори в комбинации с убывающей иммуногенностью вакцинных штаммов будут способствовать в будущем распространению диких штаммов среди высоковакцинированного населения.

Группа японских исследователей сообщила о получении мелкобляшечного варианта вируса кори со сниженной вирулентностью для новорожденных мышей (Sakae et al.,1997). Вариант был селекционирован в результате пассирования штамма Edmonston в клеточной линии NIH3T3 в течение 5 –ти месяцев. В процессе пассирования данного варианта на клетках NIH3T3 не отмечалось наличие цитопатогенного эффекта, однако на клетках Vero полученный вариант имел титр около 2 х БОЕ/мл.

В последние годы генетическая изменчивость диких штаммов вируса кори стала объектом самого интенсивного изучения в связи с обнаружением заметного генетического дрейфа этих штаммов после широкого распространения коревых вакцин. Генетические изменения были обнаружены в кодирующей части Н, F, N, P и М --генов. Наибольшая степень вариабельности среди диких штаммов вируса кори, как уже указывалось, была найдена в СООН- концевом участке N- белка протяженностью в 151 аминокислотный остаток. (Taylor et al.,1991; Rota et al.,1994a ; Rota et al.,1994b).

Подъем заболеваемости корью в США в гг. во многом объясняют изменениями в гене, кодирующем гемагглютинин у диких штаммов вируса кори, циркулирующих в это время в этой стране ( Rota et al.,1992). Было обнаружено, что Н- белок этих штаммов отличался от Н- белка вакцинного штамма Moraten в 19 позициях и включал еще один дополнительный сайт гликозилирования ( Rota et al.,1992).

Анализ нуклеотидных последовательностей, кодирующих N- белок 15 диких штаммов вируса кори, выделенных в период с 1954 по 1990 гг., и одного из вакцинных штаммов показал, что N- гены отличались по 76 нуклеотидным позициям ( 4,75%) и 18 аминокислотным позициям (3,42%). Нуклеотидные замены были распределены по всей длине N- гена, однако в пределах СООН-концевой части гена длиной 456 нуклеотидов последовательности этого гена отличались в 38 позициях ( 8,3% ).

Интересно отметить, что дикие штаммы, циркулирующие в этот период в США и Канаде были более родственны диким изолятам, выделенным в Великобритании между 1983 и 1988 гг., чем штаммы BER83 и BOS83, которые были выделены в США в 1983 г. Эти наблюдения позволяют предположить, что штаммы BER83 и BOS83 могут соответствовать тупиковой исчезающей линии диких штаммов вируса кори.

Еще одна заметная генетическая линия диких штаммов вируса кори включала изоляты из двух стран Западной Африки: Габона и Камеруна, выделенные в гг. Дикие штаммы, выделенные в США в конце 50-х годов, дикие штаммы Edmonston и PH26, штамм HAL, выделенный в Финляндии, были близкородственны вакцинному штамму Moraten и образовывали еще одну генетическую линию ( Rota et al., 1994a). Часть этой группы в N- гене имели различия только в 9 –ти нуклеотидных позициях (0,6%) и в 3-x аминокислотных позициях (0,6%).

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей М-гена небольшого числа диких штаммов, циркулирующих с 1954 по 1991 г. показал, что М-ген несколько более был консервативен на нуклеотидном уровне по сравнению с N-геном. M- гены исследованных штаммов отличались по 36 нуклеотидным позициям ( 2,6 %) и по 8 аминокислотным позициям ( 3,3%). Было обнаружено, что аминокислотные изменения в М-белке концентрируются на N- конце. Между 50-ым и 100-ым аминокислотными остатками наблюдалось наибольшее количество замен.

Существование множественных генетических линий диких штаммов витруса кори было доказано после анализа N, P, и М- генов диких штаммов, циркулирующих в разные периоды времени ( Baczko et al.,1991; Baczko et al., 1992; Taylor et al., 1991; Rota et al., 1994a). Полученные данные еще раз подтверждают вывод, что до широкого распространения коревых вакцин в 1960 г. дикие штаммы вируса кори были генетически гомогенны и могли существовать как единственная генетическая линия.

Дальнейшие исследования в этом направлении были предприняты группой Рима с сотр. ( Rima et al.,1997). C этой целью был предпринят детальный филогенетический анализ Н-генов 75 диких и вакцинных штаммов вируса кори. Анализ последовательностей СООН –концевой части N- гена 36 штаммов вируса кори показал значительную дивергенцию этого участка как на нуклеотидном ( 7,2%), так и на аминокислотном уровне (10,6%) (Taylor et al.,1991).

Согласно классификации Тейлора первая генетическая линия ( группа А) содержала все вакцинные штаммы, используемые в настоящее время. Типичным представителем этой группы является штамм Edmonston. Эта группа содержит и ранние американские изоляты, как, например, PH 26, штамм Turku, выделенный в Финляндии в 1962 г. Эта группа кроме того включает в себя штаммы Нalle, Mantooth и Horta-Barbosa, изолированные от больных, страдающих ПСПЭ.

Генетические линии могут состоять из нескольких генотипов, отражающих местные особенности той или иной генетической линии. Данные, собранные в США между 1989 и 1999гг. ясно показывают, что прекращение передачи местного генотипа D3 было достигнуто в 1993 г. Секвенирование генома местных штаммов подтвердило, что вирусы кори, изолированные с 1993 г., были членами генотипов С2, D4, D5, D6 и были импортированы в США из других регионов планеты. В 1993г. был отмечен первый документированный занос в США генотипа D4 из Индии.

Ген, кодирующий Н-белок у диких штаммов вируса кори, как уже отмечалось, отличается большим разнообразием. Поскольку Н-белок является главным иммуногеном, индуцирующим образование новых нейтрализующих антител, его вариабельность является результатом иммунологического давления на этот белок. Группой Рима с сотр. ( Rima et al., 1997) был предпринят филогенетичсский анализ Н-генов 75 диких и вакцинных штаммов вируса кори (32 опубликованных последовательности и 43 новых последовательности).

Имеется весьма незначительная информация относительно функций и генетической вариабельности первичной структуры межцистронной области генома вируса кори, расположенной между кодирующими участками М- и F- генов вируса кори. Эта область включает 3-нетранслируемый локус М-гена ( 429 н.), межгенный участок (3 н.) и 5- нетранслируемый локус F- гена (573 н.). Первичная структура 3- нетранслируемого локуса М- F области генома вируса кори была исследована Беллини с сотр. ( Bellini et al., 1986).

Также было показано, что нуклеотидная последовательность 5- нетранслируемого локуса F-гена содержит несколько потенциальных инициирующих кодонов, два из которых расположены в позициях 574 и 583. Продемонстрировано, что трансляция F- белка обычно осуществляется с AUG2- кодона в позиции 583. В отсутствие некодирующего локуса трансляция инициируется либо с AUG1 либо с AUG3 - инициирующих кодонов (Cathomen et al.,1995).

Детальный анализ вариабельности некодирующей М-F области генома был недавно проведен у штаммов вируса кори, входящих в генетические линии A,B,D,H (Markushin et al.,1997). Проведенный анализ показал, что степень вариабельности М-F области у диких штаммов вируса кори, принадлежащих к различным генетическим линиям, была необычайно высокой.

Было обнаружено, что уровень генетической вариабельности М-F области генома во всех без исключения случаях отражал уровень вариабельности других кодирующих и некодирующих участков генома вируса кори. Характер распределения нуклеотидных замещений в нуклеотидной последовательности М-F области генома при сравнении штаммов, относящихся к различным генетическим линиям не позволяет идентифицировать сколько-нибудь протяженные консервативные участки в пределах данной области генома, что свидетельствует в пользу того, что эта область генома не имеет участков с уникальной вторичной структурой, выполняющей регуляторные функции.

Анализ нуклеотидных последовательностей N-гена 38 изолятов, выделенных в Германии, Чехии, Дании, Польше и России был предпринят сотрудниками Института Р. Коха в Берлине (Santibanez et al., 1999). Был проведен анализ СООН-концевой части гена, включающей 285 нуклеотидов. Было обнаружено, что в Германии в период между 1993 и 1996 гг. циркулировало два генотипа С2 и D6, входивших, соответственно в генетические линии С и D. Изоляты генотипа С2 были родственны штаммам, выделяемым в Германии до 1993г.

Анализ нуклеотидных последовательностей СООН- концевой части N-гена диких штаммов, циркулирующих в европейской части России в 2000-м году, показал, что все они относятся к генотипу D4 ( генетическая линия D) (Markushin et al., manuscript in preparation).

Интересно отметить, что штамм Nepal, относящийся к генотипу D4, был выделен в 1997 г. на юге Непала. Как известно, Н-ген вируса кори содержит 5 потенциальных мест гликозилирования с N-связями. Они локализуются в аминокислотных остатках 168, 187, 200, 215, 238. Дополнительное место гликозилирования было обнаружено в позиции 416 Н-белка. Штамм Nepal имел в Н- белке мутации в позициях 169 ( S-A) и 211 ( G-S) при сравнении со штаммом Edmonston ( Lingyun and Yipeng., 1998).

Интересные данные были получены в отношении генетической вариабельности диких штаммов вируса кори, циркулирующих в гг. в Великобритании (Jin et al., 1997). При изучении 50 изолятов, выделенных в этой стране, было обнаружено 3 отдельных генотипа, которые были близкородственны генотипам, описанным прежде в США и континентальной Европе. Как оказалось, генотип 1 соответствовал генотипам D1 и D3 генетической линии D, генотип 2-генотипу С2 генетической линии С, и генотип 3- генотипу D2 генетической линии D.

Секвенирование части Н-гена 18 диких коревых штаммов, изолированных в Гамбии в период гг. показало высокую степень гомологии ( > 98,5%). Эти последовательности образовывали кластер, характерный только для данного географического района. Общей чертой этих изолятов было наличие трех характерных мутаций в Н-гене в позиции 7963, 8649 и 8653, не наблюдаемых в Н-гене изолятов из других географических районов (Outlaw et al., 1997).

На основании филогенетического анализа и анализа полиморфизма рестриктазных фрагментов H и N- генов диких штаммов вируса кори, циркулирующих в западной части Японии, эти дикие штаммы были распределены в два генотипа. Было показано, что в течение 10 лет штаммы, относящиеся к одному генотипу, полностью заменили штаммы, относящиеся к другому генотипу ( Katayama et al., 1997).

В южной Африке эволюция вируса кори была исследована в условиях начальной стадии противокоревой вакцинации (Kreis et al., 1997). Были проанализированы последовательности СООН- концевой части N- гена 20 изолятов, часть из которых была выделена в гг., а другая часть- в гг. Было обнаружено, что по крайней мере существует несколько различных генетических групп диких коревых штаммов, из которых одна циркулирует с 1986г. Генотип, включающий основную массу изученных штаммов, выделенных в более позднее время, характеризовался тремя специфическими мутациями в N-гене.

В отдельных регионах Европы в настоящее время продолжаются отдельные коревые вспышки благодаря недостаточной вакцинации. В Люксембурге в 1996г. была отмечена коревая вспышка с охватом 110 человек и сообщения о заболеваниях корью в этой стране продолжались до 1997г. Молекулярно-генетический анализ показал, что все изоляты относятся к генотипам С2 и D6. Дивергенция в данном конкретном случае достигала 0,2%.

З А К Л Ю Ч Е Н И Е Молекулярно- генетические исследования вируса кори, проведенные в последнее время, позволили значительно продвинуть вперед наше понимание структуры генома этого вируса, особенностей отдельных стадий его внутриклеточного цикла репродукции и его природной изменчивости.

Вместе с тем некоторые вопросы молекулярной генетики вируса кори продолжают оставаться малоизученными. В частности продолжают оставаться непонятными функция и роль некодирующей М-F области генома этого вируса. Остаются невыявленными истинные клеточные рецепторы в человеческом организме, которые взаимодействуют с вирусом в процессе обычной коревой инфекции.