Активность Cdk регулируется: Циклинами (их появлением и разрушением убиквитин- зависимым протеолизом) «грубая регуляция» Фосфорилированием комплекса Cyclin-Cdk, а именно, Cdk- по 2-м позициям: Thr167 -(T-сайт) –CAK –Cdk активирующей киназой, Tyr15 (Y-сайт) - киназой Wee1 и фосфатазой cdc25 - «тонкая регуляция» Cdk-ингибирующими белками CKI – связывается с комплексом Cyc-Cdk, нарушая активный сайт CycB P Y T Cdk1 CycB CKI Активный MPF

Генетика клеточного цикла

Ген cdc25- фосфатаза Температурочувствительные аллели блокируют в клетке переход G2-M, оставляя белок Cdc2 фосфорилированным по Y-сайту и неактивным. Через 10 мин после возвращения к пермиссивной температуре происходит активация этого белка. Фосфатаза Cdc25 дефосфорилирует Y –сайт Cdc2, стимулирует переход MPF в активную форму Активируется киназой Polo и M/Cdk (MPF) Ген wee1 - протеинкиназа Делеционные варианты аллелей вызывают преждевременное вхождение в митоз (почка меньше, чем обычно). При сверхпродукции этого белка происходит увеличение критического размера почкующейся клетки. Продукт гена wee ак, имеющий гомологию с С-концом протеинкиназ. Действует противоположно cdc25. Протеинкиназа фосфорилирует Y –сайт Cdc2 и ингибирует активность

Активация M/Cdk (MPF)

Регуляция активности Cdk : Cdk-ингибирующий белок CKI – связывается с комплексом Cyc-Cdk, нарушая активный сайт

Циклины высших эукариот М-циклины продвигают события митоза G1-циклины проводят клетку через «старт» или точку рестрикции S-циклины необходимы для инициации репликации G1/S-циклины подводят клетку к репликации

Предотвращение повторной репликации S-Cdk: -запускает репликацию ДНК -фосфорилирует Сdc6, он отделяется от ОRС- предотвращение репликации с этого ori. Фосфорилированный Сdc6 узнается комплексом SCF, убиквитинизируется, деградирует в протеосоме -фосфорилирует некоторые Mcm-белки, это вызывает их экспорт из ядра – гарантия того, что комплекс Mcm больше не соберется Активность S-Cdk остается высокой до конца цикла: в G2 и раннем митозе, предотвращая репликацию после завершения S-фазы M-Cdk предотвращает ререпликацию в митозе: продолжает фосфорилировать Сdc6 и Mcm-белки, стимулируя их экспорт из ядра RESET: в конце митоза активность всех Cdk падает до нуля. Сdc6 и Mcm-белки дефосфорилируются, pre-ORC может собираться снова.

Две системы, обеспечивающие протеолиз: APCSCF P E1 E2 E1 узнает Пришивают убиквитин Протеосома Бокс деструкции Специфически фосфорилиро- ванные белки

Переход Метафаза-Анафаза Критическое возрастание MPF Активация APC Инактивация MPF Активация сепаразы (разрушение циклина) Дефосфорилирование белков Разделение хроматид Анафаза, телофаза

Переход метафаза- анафаза Основные участники: APC - anaphase promotion complex – при добавлении субъединиц Е1 и Е2 служит убиквитин лигазой Cdc20 - белок, активирующий APC Сепараза – протеаза, разрезающая один из когезинов Секурин- белок, инактивирующий протеазу

Переход метафаза-анафаза секурин неактивная сепараза Неактивный АРС Когезиновый комплекс активный АРС Cdc20 убиквитинизация и протеолиз секурина активная сепараза M-Cdk

Цитокинез должен происходить в нужное время в нужном месте Сократительное кольцо образуется под мембраной, его плоскость перпендикулярна веретену Активированные, но неоплодотворенные яйца лягушки: нет центросомы – нет веретена – нет цитокинеза Сдвиг веретена сдвигает сократительное кольцо. Сокращение началось – веретено можно удалить – цитокинез продолжится. Активная форма MPF фосфорилирует легкую цепь миозина АТФ-азная активность миозин ингибируется, кольцо сокращаться не может P Интерфаза Метафаза Цитокинез

Поддержание инактивации M-Cdk после митоза Уровень циклина снижается за счет активности Cdc20- APC, далее выпадение G1 и накопление циклина Уровень циклина снижается за счет активности Cdc20- APC, далее –активностью Hct1-APC, Sic1 Эмбриональные клетки без G1 фазы Клетки с G1 фазой

Активность Cdk регулируется: Циклинами (их появлением и разрушением убиквитин- зависимым протеолизом) «грубая регуляция» Фосфорилированием комплекса Cyclin-Cdk, а именно, Cdk- по 2-м позициям: Thr167 -(T-сайт) –CAK –Cdk активирующей киназой, Tyr15 (Y-сайт) - киназой Wee1 и фосфотазой «тонкая регуляция» Cdk-ингибирующими белками CKI – связывается с комплексом Cyc-Cdk, нарушая активный сайт CycB P Y T Cdk1 CycB CKI Активный MPF Cdc20-APC и аналог Hct1-APC – деградация циклина. M-Cdk активирует Cdc20-APC M-Cdk инактивирует Hct1-APC Hct1-APC активируется в конце митоза, когда снижается к-во M-Cdk Sic1 – белок из группы CKI M-Cdkинактивирует Sic1 Sic1 активируется в конце митоза, когда снижается к-во M-Cdk В конце митоза снижается транскрипция М-циклина, до этого работала положительная обратная связь

Контроль прохождения G1 фазы путем изменения активности Cdk у S.cerevisia Супрессия всех Активностей Cdk гарантируется тремя способами Аккумуляция G1-циклинов٭ (на них не действуют ингибиторы). G1-Cdk запускает транскрипцию G1/S-циклинов Активность G1/S-Cdk инициирует транскрипцию S-циклинов. Инактивирует ингибиторы

Гипотетическая модель координации роста клетки и движения по клеточному циклу у дрожжей Белки, cвязывающие Cln3 G1-циклин Cln3 Cln3 синтезируется в G1 параллельно с ростом клетки. Количество Cln3 отслеживается по его концентрации рост Свободный Cln3 cвязывается с Cdk Активация S-фазы

Контроль инициации S-фазы в клетках животных Активность Cdk в G1 супрессируется Hct1, CKI (p27), снижением транскрипции циклинового гена. Регуляторный белок E2F присоединяется к промотору генов, необходимых для S, в т.ч. G1/S и S-циклинов Сигнал делиться активирует G1-Cdk Rb-туморсупрессор

Инициация репликации ДНК у S.cerevisiae Основные участники ОRС-origin recognition complex (6 белков)- прикреплен к ori в течение всего цикла Сdc6- регуляторный белок, прикрепляется к ОРС в начале G1 (фактор, вводящий геликазу) Mcm-белки – регуляторные близкородственные белки, часть пререпликативного комплекса pre-RC (гексамерная ДНК-геликаза) S-Cdk циклин S-зависимая киназа ORC Сайт присоединения ORC G1 G2-M S Cdc6 MCM Pre-RC S-Cdk запускает S фазу Деградация фосфорили- рованного Cdc6 Завершение рекликации ДНК Фосфорилирование ORC

Предотвращение повторной репликации S-Cdk: -запускает репликацию ДНК -фосфорилирует Сdc6, он отделяется от ОRС- предотвращение репликации с этого ori. Фосфорилированный Сdc6 узнается комплексом SCF, убиквитинизируется, деградирует в протеосоме -фосфорилирует некоторые Mcm-белки, это вызывает их экспорт из ядра – гарантия того, что комплекс Mcm больше не соберется Активность S-Cdk остается высокой до конца цикла: в G2 и раннем митозе, предотвращая репликацию после завершения S-фазы M-Cdk предотвращает ререпликацию в митозе: продолжает фосфорилировать Сdc6 и Mcm-белки, стимулируя их экспорт из ядра RESET: в конце митоза активность всех Cdk падает до нуля. Сdc6 и Mcm-белки дефосфорилируются, pre-ORC может собираться снова.

Точки контроля клеточного цикла у дрожжей Метафаза- анафаза G1-S Переход М-А, контроль -дефект веретена -дефект полюсов -дефект кинетохоров К неприкрепленному кинетохору присоединяется белок Mad2, ингибируется Cdc20-APC Мутации: mad- metaphase arrest deficient, bub – budding uninhibited benomyl G2-M. Контроль завершения репликации. Распознаются -нереплицированные участки -незавершенные вилки, Блокирует активацию M-Cdk. Мутанты cdc2-3wD, cdc2-F15D, rad24 вступают в суицидальный митоз сенсор Передача сигнала Клеточный осциллятор

Точки контроля клеточного цикла: G2 Контроль повреждения ДНК. Поврежденная ДНК – киназы – инактивируют Cdc25 Блок активации M-Cdk Мутации rad1, rad3, rad24, rad9 (регулятор репликации), rad17(экзонуклеаза), hus1, hus2 G1 контроль повреждения ДНК. Поврежденная ДНК – киназы – инактивируют Cdc25 Блок активации G1/S-Cdk, S-Cdk Передача сигнала- протеинкиназы : Mec3, Rad53 G1 контроль роста клетки перед Стартом cln3D

Mdm2 p53 P P ДНК γ-лучи Деградация в протеосоме Стабильный активный р53 протеинкиназы Ген р21 Транскрипция, трансляция G1/S-Cdk S-Cdk G1- арест в ответ на повреждения ДНК Убиквитин лигаза

Апоптоз: Клетка сморщивается, цитоскелет сжимается Ядерная оболочка распадается ДНК режется на фрагменты Клеточная поверхность меняется, вызывая быстрый фагоцитоз клетки макрофагами или соседями Каспазы - протеазы, имеющие цистеин в активном сайте и разрезающие белки-мишени по аспарагиновой кислоте – caspases Синтезируются в виде прокаспаз, хранятся в клетке долгое время. Активируются другими каспазами разрезанием по аспарагиновой кислоте. Амплификация протеолитического каскада. Разрушение ламины. Разрезание белка, инактивирующего ДНКазу – разрезание ДНК.

Активация прокаспазы Каспазный каскад Адапторный белок собирает инициаторные прокаспазы в комплекс или агрегат. Они взаимно активируют друг друга

Активация апоптоза с внешней стороны Лимфоцит-киллер активирует death –рецепторы на поверхности клетки: белок Лиганд Fas присоединяется к Fas-рецептору Fas кластеризуются, к ним присоединяются адапторные белки и прокаспазы-8. Взаимная активация и каскад. Некоторые стрессированные или поврежденные клетки убивают себя сами, продуцируя и Fas-лиганд, и Fas-рецептор. Активация апоптоза с внешней стороны

Активация апоптоза изнутри клетки Если клетка повреждена или стрессирована, она может убить себя, вызывая агрегацию и активацию прокаспаз. Один из путей: митохондрии индуцируются к выбросу цитохрома с в цитозоль. Цитохром присоединяется к адапторному протеину Apaf-1. Белки семейства Bcl-2 – внутриклеточные регуляторы активации прокаспаз: ингибируют апоптоз, блокируя выброс цитохрома с, наоборот, стимулируют выброс (Bax, Bak), наоборот, ускоряют активацию прокаспаз, Bid активирует Bax и Bak Цитохром с выходит из межмембранного пространстива

Надклеточный контроль клеточного деления, роста и апоптоза Размер организма и органа зависит от числа клеток и их массы. Число клеток определяется их рождением и гибелью Экстраклеточные сигналы, регулирующие эти процессы, часто называют «факторы роста» в широком смысле. Для точного выражения следует различать: 1.Митогены – стимулируют клеточные деления, снимая внутриклеточный блок с продвижения по циклу. 2.Ростовые факторы – стимулируют увеличение массы клетки, вызывая синтез макромолекул и ингибируя их деградацию 3.Факторы выживания – супрессируют апоптоз

Митогены (более 50 белков ) Фактор роста тромбоцитов PDGF –platelet-derived grows factor Клетки фибробластов в культуре делились с добавлением сывортки крови и не делились в плазме. Плазма – забирают жидкую часть крови без образования сгустка. Сыворотка – то же после образования сгустка. Клетки делились при добавлении экстракта фибробластов В организме фибробласты стимулируют деление клеток при заживлении ран. EGF –epidermal growth factor PDGF (фибробласты, гладкие мышечные, нейроглиальные) и EGF – широкого спектра дейстия Эритропоэтин – только для эритроцитов TGF-β – трансформирующийся фактор роста – одни клетки стимулирует, другие ингибирует

Один из путей стимуляции клеточных делений митогеном Small GTPasa Ras MAP-киназный каскад Активация гена Myc ? Многие компоненты внутриклеточных сигнальных путей оказываются онкогенами Гиперактивный Ras- продукт мутантного гена ras часто вызывает рак (30%) Мутация 1 ак в Ras – перманентная активность, постоянная стимуляция сигнального пути

Ras- мономерная GTF-аза, имеет пренильную группу. MAP- mitogen-activated protein kinase (MAP-киназа). Входит в ядро и фосфорилирует гено- регуляторный комплекс, активируя транскрипцию «непосредственно ранних генов» через минуты после сигнала Стимуляция митогеном сигнального пути Ras Серин- треонин киназы Тирозин киназа EGF- подъем МАР-активности через 5 мин, деления NGF- MAP-активность высока часами, Остановка пролиферации, дифференцировка

В большинстве нормальных клеток гиперактивация Ras и Myc приводит к активации точки контроля. Нормальная клетка в состоянии различить аномальную стимуляцию. Повышенная стимуляция митогенного пути индуцирует арест клеточного цикла или апоптоз Синтез ингибиторного белка р19ARF, который присоединяется к Mdm2 и ингибирует его. Возрастает уровень р53 – арест или апоптоз В раковых клетках эта система часто инактивируется мутациями в компонентах точки контроля

Другие способы регуляции митогенной активности Белок CKI p27 в клетках, которые делятся определенное число раз, прежде чем войдут в перманентный арест при терминальной дифференцировке. У мышей, дефицитных по р27, общее число клеток увеличино Репликативное старение клеток, связанное с теломерами. У фибробластов через делений с митогенами в среде наступает арест. Активация пути р53 в ответ на повреждения теломер. У грызунов теломераза активна. Контроль над делениями осуществляется механизмом p19ARF. Мутации в нем могут приводить к «бессмертию» культуры клеток

Факторы роста У одноклеточных для роста необходимы только питание.У многоклеточных – ростовой фактор. Путь PI 3- фосфотидилинозитол-киназы S6 киназа фосфорилирует белок S6 рибосом – трансляция набора mРНК, кодирующего рибосомные компоненты Мутация в гене S6 киназы у дрозофилы: мухи мелкие, клетки мелкие, число нормальное Активация фактора инициации трансляции eIF4E Увеличение продукции регуляторного белка Myc. Он увеличивает транскрипцию белков, вовлеченных в клеточный метаболизм и синтез макромолекул

Возможные превращения PI 3 под действием PI 3-киназы Фосфолипаза С Создание докинг-сайтов для внутриклеточных сигнальных белков Инозитол фосфолипид фосфотаза

Внеклеточные сигнальные белки могут действовать как ростовой фактор и как митоген одновременно: PDGF –фактор роста тромбоцитов Ras PI3-kinase MAP-kinase Myc Рост клеткиДеление клетки Связь роста и пролиферации гарантирована В некоторых клетках рост и пролиферация контролируются независимо (эмбриогенез). Симпатический нейрон исключен из цикла, но растет пропорционально количеству NGF (nerve grows factor), который выделяет клетка-мишень

Tyr740 Tyr751 Tyr771 Tyr1009 Tyr1021 Рецептор PDGR – фактора роста тромбоцитов одна из цепей димера Тирозинкиназные домены Фосфотирозины служат докинг-сайтом для различных белков, имеюших домены SH2 (src homology region), SH3 PI3-киназа GTPase активирующий белок Фосфолипаза С -PLC

Факторы выживания Внеклеточные факторы, супрессирующие апоптоз Если клетки лишены факторов выживания, они активируют программу апоптоза. Нервные клетки образуются в избытке и конкурируют за фактор, выделяемый мишенями

Фактор выживания супрессирует апоптоз у млекопитающих Протеинкиназа В Рецептор фактора выживания активирует протеинкиназы, в т.ч. PKB. Bad ингибирует Bcl-2 РКВ: 1. Активирует ингибитор апоптоза Bcl Ингибирует ген, вызывающий апоптоз

Фактор выживания супрессирует апоптоз у дрозофилы Стимуляция ингибитора апоптоза IAP У дрозофилы и, вероятно, у позвоночных

Внеклеточные сигналы, ингибирующие рост TGF-β –большое семейство родственных белков. Растворимые димеры, действуют как гормоны или локальные медиаторы. Суперсемейство: TGF-β, активины и BMP TGF-β ингибирует пролиферацию нескольких типов клеток, блокируя клеточный цикл в G1 или стимулируя апоптоз. Градуирующие морфогены Активирует путь Smads. Изменения в транскрипции генов, регулирующих клеточные деления, дифференцировку, образование внеклеточного матрикса и смерть. BMP- bone morphogenetic protein из семейства TGF-β. Помогает включить апоптоз в тканях между развивающимися пальцами. Myostatin (то же семейство) – ингибирует пролиферацию миобластов.

Внеклеточные сигналы, ингибирующие рост Стратегия наиболее быстрой передачи сигнала в ядро

Методы обнаружения мутаций у Drosophila Мёллер 5: y M5 X леталь X y M5 леталь любая леталь Мутации в гаметах y M5 Выведение хромосомы на уровень организма

Методы обнаружения мутаций у Drosophila Нерасходения хромосом в мейозе- мутации mei M5 X y X y pn v y m Мутации в гаметах y+ Выведение хромосомы на уровень организма y+ y pn v X Размножение мутантной хромосомы Индивидуальные скрещивания «Летали» погибают, «слабые дефекты» выживают

y pn V 0 y+ y pn v y+ y pn V 0 y+ y pn V y+ Нерасхожд. в М1 Нерасхож. в М2 y y y y y y y y pn, v y,pn,v,pn,v y y pn v

Поиск мутагенчувствительных мутаций. Мутации, нарушающие репарацию-mus Мутации, в гомозиготе вызывающие гибель личинок на среде с мутагеном, не вызывают гибели без мутагена w y Basc mal w w w ЭМС х х индивидуально

Метод поздних леталей. Нашли мутагенчувствительную леталь, гибнущую в 3-м личиночном возрасте (множественные разрывы хромосом) Линия, позволяющая получать гомозиготы по поздним леталям Инсерция Р-элемента, содержащего у+, в балансер CyO (2-я хромосома): y w; l(2) / y+ CyO y w l l l Cy O y+ Личинки живут, нет имаго Ранняя леталь Жизнеспособные личинки и мухи

3-я хромосома маркирована генами клеточного деления: gnu, polo, mgr, asp, stg Хромосома, обработанные мутагеном Обнаружены : аллели всех мутаций, новые мутации, проявляющие летальное взаимодействие с этими генами Поиск мутаций по взаимодействию с определенными генами gnu- Giant nuclei asp- abnormal spindle mgr- merry go round stg- string- протеинфосфатаза, гомолог cdc25 S.pombe polp- серин-треонин-протеинкиназа, белок метафазных хромосом. Монополярное веретено Тест на летальность

+ l f y + G1G2 y + y f y + + l f + l + G1 Явление соматического кроссинговера используют для тестирования мутаций Влияние мутаций на частоту одиночных и двойных клонов, потерю и нерасхождение хромосом (по потере доминантного маркера), характер клонов Тестировали мутации mei, mit

Ловушка энхансеров P{lArB} 5 3 LacZ ry+ PL3 Геномная ДНК Adh LacZ – β-галактозидаза E.coli, Adh – алкогольдегидрогеназы дрозофилы, ry+ - ксантиндегидрогеназы дрозофилы, Bluescript- плазмида, несет ген устойчивости к ампицилину, PL1-4 - полилинкеры PL1 PL2PL4 Bluescript

Метод GFP-белковой ловушки Экзон 1 Интрон 1 Интрон 2 P 5ген GFPP 3 сайты сплайсинга GFP PDI Интрон-экзонная структура гена Сплайсинг мРНК GFP-гибридный белок Полноразмерный транскрипт Копия экзона 1 Копия экзона 2 Копия экзона 3 Экзон 2 Экзон 3

FLP-FRT система для искусственной митотической рекомбинации hs-FLP ry+ При индукции FLP рекомбиназы происходит митотический обмен между двумя одинаково ориентированными FRT сайтами на стадии 4-х хроматид. Применение системы для маркирования мозаичного клона в ткани: FRT GFP белок появится, если спейсер удален. FRT 1.линии, содержащие FLP- рекомбиназу, работающую под промотором теплового шока 2. линии, содержащие встройки Р- элемента с геном white+ и FRT- сайтами промотор GFP- белок Вариант: UAS-FLP ; GAL4 ; FRT вводят мутацию + + FRT

Исследование взаимодействия белков с помощью FRET Fluorescent resonance energy transfer

Ловушка белок-белковых взаимодействий – дрожжевая дигибридная система. α A B Ген репортер Транскрипционный фактор с сайтами A и B в плазмиде α Приготовим плазмиду, cодержащую изучаемый белок X сшитый с фрагментом, содержащим сайт A. β A X A X Приготовим «библиотеку» всех белков Y, пришитых к сайту B в плазмиде γ γ Y B Y B

Трансформируем клетку дрожжей, такими концентрациями плазмидных ДНК, чтобы в клетку попало только одна копия плазмиды γ. α Ген репортер A X Y B Если белок Y из библиотеки физически взаимодействует с изучаемым белком X, то соберется транскрипционный фактор, который начнет транскрипцию гена- репортера. Это позволит увидеть клетки в которых имеются белки, взаимодействующие с X.