Кафедра медицинской биологии, микробиологии, вирусологии и иммунологии ГЕНЕТИКА БАКТЕРИЙ И ВИРУСОВ. ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ И ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ. Лектор ас. Е.В. Покрышко

План лекции Строение генетического аппарата клетки. Строение генетического аппарата клетки. Внехромосомные элементы наследственности. Внехромосомные элементы наследственности. Мутации. Мутации. Рекомбинации. Рекомбинации. Основы генной инженерии. Основы генной инженерии. Генетика вирусов. Генетика вирусов.

История развития молекулярной биотехнологии ГодСобытие 1917 Карл Ереки ввёл термін биотехнология Карл Ереки ввёл термін биотехнология 1944 Евери, МакЛеод, МакКарти доказали, что генетическим материалом является ДНК 1953 Уотсон и Крик расшифровали структуру ДНК 1970 Виделена пераая рестриктирующая эндонуклеаза 1973 Бойєр, Коэн заложили основу технологии рекомбинантных ДНК (гибрид фага λ м E. coli) 1978 Получено первый человеческий инсулин 1982 Первая вакцина для животных 1988 Открыто метод ПЦР

История развития молекулярной биотехнологии ГодСобытие 1990Начало работы над проектом Геном человека 1996Продажа первого рекомбинантного белка эритропоэтина перевысила 1 млрд долларов США 1996Определено генетическую последовательность всех хромосом эукариотического организма Saccharomyces srevisiae 1997 Клоновано млекопитающего из соматической клетки

F. Crick i J. Watson

Генетический материал бактерий Генетический материал бактерий представлен: одна, замкнутая в кольцо 1.хромосомой ( одна, замкнутая в кольцо ) 2.внехромосомными элементами наследственности: плазмидами транспозонами IS-элементами

Плазмиды Плазмиды необязательные компоненты микробных клеток, могут иметь линейную или кольцевую структуру, и неспособны к самостоя- тельной репликации. Транспозоны – мигрирующие элементы, имеют гены для переноса внутри клеток и одновременно содержат гены резистентности к антибиотикам, ионам тяжелых металов. – IS-элементы – мигрирующие гены, которые способны на перенос внутри клеток и с одного участка ДНК на другой; е - плазмиды - обязательный компонент микробных клеток, в состав которых входит ДНК и РНК.

Транспозон и IS элемент Транспозон содержит структурные гены иповторяющиеся участки

1. Координирующая: взаимодействие транспозонов, плазмид, умеренных фагов между собой и хромосомой бактерии, обеспечивая их репликацию. 1. Координирующая: взаимодействие транспозонов, плазмид, умеренных фагов между собой и хромосомой бактерии, обеспечивая их репликацию. 2. Регуляторная: вызывают инактива- цию генов, или служат промоторами (участки ДНК, которые регулируют экспрессию клеточных генов). 2. Регуляторная: вызывают инактива- цию генов, или служат промоторами (участки ДНК, которые регулируют экспрессию клеточных генов). 3. Индуцируют мутации по типу делеции или инверсии 3. Индуцируют мутации по типу делеции или инверсии Функции IS-элементов

1. Регуляторная. 1. Регуляторная. 2. Кодирующая. 2. Кодирующая. 3. Индуцируют мутации. 3. Индуцируют мутации. 4. Вызывают хромосомные аберрации. 4. Вызывают хромосомные аберрации. Функции транспозонов

Классификация плазмид По размещению в клетке: внехромосомные внехромосомные интегрироованные интегрироованные По типу передачи: конъюгативные конъюгативные (трансмиссивные, имеют tra-ген) неконъюгативные неконъюгативные По признакам, обуславливают По признакам, что обуславливают определённые свойства определённые свойства микроорганизмов микроорганизмов

Види плазмід Сol – продукция колицинов Сol – продукция колицинов HLy – продукция гемолизинов HLy – продукция гемолизинов Tol – расщепление толлуола, ксилола Tol – расщепление толлуола, ксилола Ent – продукция энтеротоксина Ent – продукция энтеротоксина Nif – связывание азота у K. pneumoniae Nif – связывание азота у K. pneumoniae Ti – образование опухолей у растений Ti – образование опухолей у растений Плазмиды деградации: Плазмиды деградации: Саm – расщепление камфоры Саm – расщепление камфоры Oct - расщепление октана Oct - расщепление октана Sal - расщепление салицина Sal - расщепление салицина Виды плазмид

Функциональные свойства плазмид Антибиотико- резистентность пенициллин Гибель клетки пенициллин Пролиферация антибиотико- резистентных штаммов R-плазмида Фертильность Реципиент F-плазмида F-пили Донор Вирулентность Нетоксигенный штамм Плазмида вирулентности Токсин Метаболизм

Види плазмід 1. Регуляторная 1. Регуляторная 2. Кодирующая. 2. Кодирующая. Функции плазмид

По происхождению: спонтанные индуцированные индуцированные По локализации: нуклеоидные цитоплазматические цитоплазматические По количеству генов, которые мутировали: генные генные хромосомные хромосомные По величине: большие (хромосомные) малые (точковые) малые (точковые) Мутации

Види плазмід Инверсия Инверсия Дупликация Дупликация Делеция Делеция Дислокация Дислокация Хромосомные мутации :

Види плазмід делеция делеция инсерция (вставка) инсерция (вставка)замена: транзиция (пуриновая основа – на пуриновую, пиримидиновая – на пиримидиновую) транзиция (пуриновая основа – на пуриновую, пиримидиновая – на пиримидиновую) трансверзия (пуриновая основа – на пиримидиновую и наоборот) трансверзия (пуриновая основа – на пиримидиновую и наоборот) Точковые мутации :

Мутагенные факторы Физические: 1. УФО (λ-2600 А) – наиболее сильное мутагенное действие; образуются димеры тимина, смена основ 2. Ионизирующее излучение (рентгеновское, гамма-лучи)

Мутагенные факторы Химические: 1. Азотистая кислота 2. N-нитрозометилмочевина – супермутаген, канцероген 3. Этилметансульфонат 4. Акридины 5. Нитрозогуанидин 6. Аналоги основ (5-бромурацил, 2-аминопурин) 7. Лекарственные препараты (нитрофураны, некоторые антибиотики

Мутагенные факторы Биологические: перекись водорода перекись водорода антибиотики антибиотики бактериофаги бактериофаги

Действие разных мутагенов на бактерии Различные физические и химические факторы повышают частоту мутаций. Ультрафиолетовое излучение и диоксин являются мутагенами и вызывают образование мутантов (коасные клетки)

R- и S- формы колоний

Свойства микробов S-колоний Клетки нормальной морфологии Клетки нормальной морфологии Диффузное помутнение бульона Диффузное помутнение бульона У подвижных видов есть жгутики У подвижных видов есть жгутики У капсульных вариантов есть капсулы У капсульных вариантов есть капсулы Биохимически более активны Биохимически более активны Полноценны в антигенном отношении Полноценны в антигенном отношении У патогенных видов – вирулентны У патогенных видов – вирулентны Выделяют в остром периоде заболевания Выделяют в остром периоде заболевания Чувствительны к бактериофагам Чувствительны к бактериофагам Менее чувствительны к фагоцитозу Менее чувствительны к фагоцитозу

Методы выявления мутантов По разнице скорости роста (посев на минимальную среду) По разнице скорости роста (посев на минимальную среду) Различная способность к выживанию Различная способность к выживанию Метод реплик Ледерберга Метод реплик Ледерберга

Метод реплик Полноценная среда Минимальная среда для обнаружения ауксотрофов

Световая репарация - рассоединение тиминовых димеров ферментами в присутствии света

Темновая репарация 1. деградация прилегающих к поврежденному участку ДНК 2. вырезание при помощи рестриктаз поврежденных участков, 3. востановление удаленного участка при помощи фермента ДНК зависимой ДНК полимеразы 4. сшивание ДНК- лигазами

SOS-реактивация При множественных повреждениях участки с мутациями переводятся в неактивное состояние, а их роль выполняет неповрежденный участок ДНК

Трансформация Трансформация ( опыты Гриффитса, 1928; Евери Мк Леода и Макарти, 1944)

ТРАНСФОРМАЦИЯ

ТРАНСДУКЦИЯ ТРАНСДУКЦИЯ (Циндер и Ледерберг, 1952) Виды: общая общая (генерализированная) специфическая специфическая абортивная абортивнаяВызывают умеренные, дефектные фаги

ТРАНСДУКЦИЯ

Специализированная трансдукция

ОТЛИЧИЯ ТРАНСДУКЦИИ и ФАГОВОЙ КОНВЕРСИИ Трансдукция – перенос генетической информации из клетки в клетку при помощи фага Фаговая конверсия - экспрeссия в клетке генов бактериофага (Corynebacterium diphtheriae, Clostridium botulinum, Staphylococcus spp., Salmonella spp.)

КОНЪЮГАЦИЯ КОНЪЮГАЦИЯ – (Ледерберг и Тейтум, 1946)

рекомбинациии Трансдукция Конъюгация Трансформация

Трансдукция – передача генетического материала от донора реципиенту при помощи бактериофага. Трансформация – передача генетического материала от донора реципиенту при помощи изолированной ДНК. Трансформация – передача генетического материала от донора реципиенту при помощи изолированной ДНК. Конъюгация - это передача генетического материала от бактерии- донора к бактерии-реципиенту путем непосредственного контакта.

Молеку-лярнаябиология Микро-биология Биохимия Химическаяинженерия Генетика Клеточнаябиология Молекулярнаябиотехнология Высоко-урожайныекультурыЛекарст- венные пре- паратыВакциныДиагно-стическиеметодыВысо-копродуктив- ные сельскохо- зяйственныеживотные

ПРОДУЦЕНТЫ, которые чаще всего используются в биотехнологии ЭУКАРИОТЫ – ЭУКАРИОТЫ – дрожжи, плесневые грибы, культуры клеток животных, людей и растений ПРОКАРИОТЫ – ПРОКАРИОТЫ – кишечная палочка, аэробные бациллы, псевдомонады, актиномицеты.

Хромосомная карта E. coli

Биотехнологические продукты микроорганизмов - продуцентов сами клетки как источник продукта крупные молекулы (ферменты, токсины, антигены, антитела, пептидогликаны и др.) низкомолекулярные метаболиты, необходимые для роста клеток (аминокислоты, витамины, нуклеотиды, органические кислоты). антибиотики, алкалоиди, токсины, гормоны

СФЕРЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОТЕХНОЛОГИИ

Основные продукты, которые получают при помощи биотехнологии В медицине В ветеринарии та с/х В пищевой промышлености В химической промышлености и энергетике АнтибиотикиВитаминыАминокислотыГормоныВакцины Компоненты крови Диагностические препараты Нуклеиновые кислоты Противоопухоле вые агенты. Кормовий белок Пищевые антибиотики ВитаминыГормоныВакцины Биологические средства защиты растений ИнсектицидыАмінокислоти Пищевой белок ФерментыАцетонЭтиленБутанолБиогазСпирты

Некоторые гормоны человека, продуцируемые рекомбинантнимы микроорганизмами Белок Название препарата Инсулин Гумулин, Новолин Соматостатин Протропин, Гуматроп Интерферон-альфа Роферон, Велферон Интерферон-гаммаАктимун Интерферон-бета Фрон, Бетасерон Интерлейкин-2Пролейкин Фактор некроза опухолей - Эритропоэтин Прокрит, Эпоген Гранулоцит колоние- стимулюющий фактор Филграстин, Ньюпоген Плазминоген активатор Актилиз

Генная инженерия – направленное изменение генома продуцента в нужном для человека направлении: пересадка в геном продуцента генов других организмов (человека, животного, растения), кодирующих синтез необходимого человеку продукта.

ИНСТРУМЕНТЫ" ДЛЯ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ ФЕРМЕНТЫ (рестриктазы, лигазы, обратная транскриптаза) ФЕРМЕНТЫ (рестриктазы, лигазы, обратная транскриптаза) ВЕКТОРЫ (плазмиды, умеренные бактериофаги, космиды, транспозоны, вирусы) ВЕКТОРЫ (плазмиды, умеренные бактериофаги, космиды, транспозоны, вирусы)

СХЕМА ГЕННО - ИНЖЕНЕРНОГО ЭКСПЕРИМЕНТА определение локализации необходимого гена (сиквенс, генетическая карта) - клонирование (выделение) необходимого гена при помощи рестриктакз определение локализации необходимого гена (сиквенс, генетическая карта) - клонирование (выделение) необходимого гена при помощи рестриктакз взможно выдиление иРНК и комплементарный синтез необходимого гена при помощи обратной транскриптазы взможно выдиление иРНК и комплементарный синтез необходимого гена при помощи обратной транскриптазы соединение изолированного гена с геномом вектора при помощи ферментов (рестриктаз, лигаз) соединение изолированного гена с геномом вектора при помощи ферментов (рестриктаз, лигаз) введение рекомбинантного вектора в клетку- продуцент введение рекомбинантного вектора в клетку- продуцент

БИОТЕХНОЛОГИЯБИОТЕХНОЛОГИЯБИОТЕХНОЛОГИЯБИОТЕХНОЛОГИЯ

БИОТЕХНОЛОГИЯБИОТЕХНОЛОГИЯБИОТЕХНОЛОГИЯБИОТЕХНОЛОГИЯ

ГЕНОТЕРАПИЯГЕНОТЕРАПИЯГЕНОТЕРАПИЯГЕНОТЕРАПИЯ

ГЕНЕТИКА ВИРУСОВ Способы увеличения информации: двухразовое считивание одной иРНК с других инициирующих кодонов двухразовое считивание одной иРНК с других инициирующих кодонов сдвиг рамки трансляции сдвиг рамки трансляции сплайсинг (вырезание интронов) сплайсинг (вырезание интронов) транскрипция с участков ДНК, что перекрываются транскрипция с участков ДНК, что перекрываются

У вирусов могут быть: Модификации (изменение состава белков капсида, суперкапсида под влиянием клеток) Модификации (изменение состава белков капсида, суперкапсида под влиянием клеток) Мутации (размер бляшек под агаровым покрытием, нейровирулентность для животных, чувствительность к действию химиотерапевтических агентов, ts-мутации – температурочувствительные – вирус теряет способность размножаться при повышенной температуре Мутации (размер бляшек под агаровым покрытием, нейровирулентность для животных, чувствительность к действию химиотерапевтических агентов, ts-мутации – температурочувствительные – вирус теряет способность размножаться при повышенной температуре Рекомбинации Рекомбинации

ВИДЫ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕКОМБИНАЦИЙ У ВИРУСОВ 1. РЕКОМБИНАЦИИ: междугенная – междугенная – обмен генами обмен генами внутригенная – внутригенная – обмен частями генов обмен частями генов

ВИДЫ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕКОМБИНАЦИЙ У ВИРУСОВ 2. Множественная реактивация: вирусная инфекция вызывается путём заражения вирионами с поовреждённым геномом, так как функцию этого гена выполняет вирус, у которого ген не повреждён. Потомство – неповреждённые вирусы. 3. Пересортировка генов: между вирусами, имеющими сегментированные геномы (вирусы гриппа человека, уток, свиней, буньявирусы, аренавирусы, реовирусы). Гибридные формы називают реасортанты.

ВИДЫ РЕКОМБИНАЦИЙ У ВИРУСОВ 4. Гетерозиготность: одновременной репродукции нескольких вирионов, разных по наследственным свойствам, образуются вирионы, которые содержат геном одного из родитеских штаммов и часть генома другого вируса (диплоидные или полиплоидные вирусы). Такое объединение не наследуется, но разрешает дать потомство с разными свойствами. Это вирусы гриппа, болезни Ньюкасл.

ВИДЫ РЕКОМБИНАЦИЙ У ВИРУСОВ 5. Транскапсидація: частЬ чужеродного генетического материла, заключённого всередину капсида другого вируса, способна переноситься в стабильной форме в чувствительные к основному вирусу клетки. Аденовирусы человека не размножаются в клетках обезьян. Но при одновременном культивировании аденовирусов и вирусов SV-40 под одним капсидом оьразуется вирус, содержащий геномы обоих вирусов, способный размножаться в клетках обезьян.

ВИДЫ РЕКОМБИНАЦИЙ У ВИРУСОВ 6. Кросс-реактивация (спасение маркера): реактивация инактивированного генома неинактивированным.

ВИДЫ НЕГЕНЕТИЧЕСКОГО ВЗАЄМОДЕЙСТВИЯ ВИРУСОВ 1. Фенотипическое смешивание 2. Негенетическая реактивация 3. Комплементация 4. Стимуляция 5. Интерференция