Московская гимназия на Юго-западе 1543 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Генотипирование генов главного комплекса гистосовместимости по локусу HLA. Юртаева С., Коробко Е. Научный руководитель: Доктор биологических наук Юрий Борисович Лебедев. Москва 2011

Введение. Аутоиммунные заболевания – это заболевания, нарушающие работу иммунной системы, которая начинает уничтожать собственные клетки организма. Анкилозирующий спондилит (АС) – аутоиммунное заболевание, для которого характерно развитие воспаления суставов осевого скелета с последующим формированием участков окостенения.

Наша гипотеза: Мы предположили ассоциацию риска развития заболевания с однонуклеотидной заменой в гене MICA, находящегося в HLA – локусе шестой хромосомы человека

HLA–локус содержит весь кластер генов главного комплекса гистосовместимости (MHC). MHC – это большая группа белковых молекул на поверхности большинства клеток здорового человека, которая служит для распознавания своих и чужих пептидных цепочек.

Белки МНС включают два основных класса:

Еще одна функция МНС белков состоит во взаимодействии с NK клетками (клетками врожденного иммунитета).

MICA – стресс- индуцируемый HLA- подобный белок. Этот белок распознается специальным(и) рецептором(ами) NKG на поверхности NK- и некоторых Т- клеток.

ПЦР Из приблизительно 50-ти известных аллельных вариантов, отличающихся один от другого набором однонуклеотидных замен, лишь несколько замен предполагают функциональные последствия, так как приводят к замене аминокислоты. Для определения нуклеотидной замены мы использовали метод ПЦР (полимеразная цепная реакция), который позволяет добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов ДНК в пробе.

Мы исследовали три возможные однонуклеотидные замены в 3-ем экзоне гена (Met на Val в двух различных участках гена MICA, и замены His на Leu в одном случае.) А) rs (Met152Val) Б) rs (Met174Val)

Цели и задачи Целью нашей работы было сравнение вариабильности геномов по локусу гена главного комплекса гистосовместимости (HLA-локусу) MICA в выборках здоровых доноров и больных аутоимунными заболеваниями (анкилозирующим спондилитом). Для выполнения данной цели нами были поставлены следующие задачи: Определить частоты трех однонуклеотидных замен (SNP) в исследуемых выборках. Выяснить, существует ли разница в частоте исследуемых аллелей между группой больных и здоровых людей.

Этапы постановки ПЦР 1) промотор 2)некодирующая область 3) экзон 4)интрон 5)прямой праймер 6)обратный праймер 7)однонуклеотидные замены

ПраймерНуклеотидная последовательность (5 – 3) Примечания MICA-For1GGAGGGCCAGGGAGGCATACI ПЦР MICA-Rev1GAGGGTTTCCCTGGACACAT MICA-For2CTCCAGGAGATTAGGGTCTGTпрямой для II ПЦР MICA-Rev2-С(Val)GCTCTGGAGGACTGGGGAACдля маркера rs MICA-Rev2- Т(Met) GCTCTGGAGGACTGGGGAAT MICA-Rev2-НTGCATGCATAGCGTGATTGTдля маркера rs MICA-Rev2-LTGCATGCATAGCGTGATTGA MICA-Rev2-MTGATAGTGTGTCTTGGTCTTGATдля маркера rs MICA-Rev2-VTGATAGTGTGTCTTGGTCTTGAC

Мы проводили генотипирование среди двух выборок: 25 здоровых людей и 20 людей больных анкилозирующим спондилитом

Результаты ПЦР-I

Результаты ПЦР-II генотип T/T C/T C/T C/T (маркер rs )

ГруппаID () аллелиГенотип MICA rs rs rs MVHLMV Больные M/V,H/H,M/V M/V,H/H,M/M M/V,H/H,M/M M/M,H/H,M/V

Далее мы посчитали частоты встречаемости гомо и гетерозигот для выборки больных и здоровых доноров и частоту встречаемости отдельного аллеля в этой выборке.

маркергенотипсредне- популяционная частота выборка p Больные (n=25) Здоровые (n=20) Rs C/C0,04(1)0,10 (2) C/TC/T0,60 (15)0,60 (12) T/TT/T0,36(9)0,28(6) fc0,7930,340,

Для проверки статистической достоверности различий в частотах встречаемости минорных аллелей между выборками больных и здоровых доноров мы использовали пакет программ для статистической обработки данных генотипирования OpenEpi. Учитывая небольшой размер анализируемых выборок мы применяли оценку по точному критерию Фишера.

Disease (+)(-) (+) Exposure(-) В качестве примера представлена «2х2 Таблица» интернет-ресурса OpenEpi, заполненная в соответствии с частотами аллелей по маркеру rs

Выводы По результатам генотипирования нами установлено, что в исследованных выборках: - отсутствует полиморфизм по маркеру Rs38(HL), т.к. частота минорного аллеля равняется нулю. - частоты встречаемости аллелей «С» по маркерам rs и Rs415 существенно отличаются от представленности данных аллелей в усредненной популяции европеоидов, что может свидетельствовать о сцепленности маркеров с другим геном HLA-локуса – геном HLA B27 - обнаруженные отличия частот аллелей у больных и здоровых не являются статистически достоверными Для российской популяции показано отсутствие ассоциации стресс-индуцируемого HLA-подобного гена MICA с развитием аутоиммунных артропатий.

Благодарности. Мы выражаем свою благодарность Институту биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и всю лабораторию сравнительной и функциональной геномики за предоставленную возможность выполнить нашу научную работу. Особенно мы хотим поблагодарить нашего научного руководителя Юрия Борисовича Лебедева за чуткое руководство, отзывчивость и неоценимую помощь. Также мы благодарим Сергея Менделевича Глаголева за организацию практики.