Физико-химические основы патологии клетки Российский Государственный Медицинский Университет Московский Государственный Университет Ю. А. Владимиров Москва © 1999 Митохондрии и апоптоз

Обратимое набухание Норма Сохранена форма хроматина Митохондрии измененыРазрыв мембран Необратимое набухание Дезинтеграция Конденсация (cell blebbing) Фрагментация Вторичный некроз Сохранена структура митохондрий Intact membranes Апоптотические тельца Ядро изменено АПОПТОЗ НЕКРОЗ Морфология клетки при некрозе и апоптозе

Apoptosis in neutrophils Fig. 4. Morphology of apoptotic neutrophils. 100,000 purified neutrophils were cytocentrifuged and the slides were then fixed and stained as indicated in Materials and Methods. (A) Freshly purified neutrophils; (B) purified neutrophils incubated in standard culture conditions for 22 h (spontaneous apoptosis); (C) purified neutrophils incubated with 27 mU/ml XO for 10 h; (D) purified neutrophils incubated with 5 mU/ml GO for 10 h. control glucosoxidase xantinoxidase spontaneous

Немитохондриальный путь активации апоптоза FADD / MORT1 DED TRADD DD [49] [50,51] [46] TNF receptor Fas receptor [52] Caspase-8 (Active) [53,54] Procaspase-1 Procaspase-8 Caspase-1 Apoptotic cascade FADD/MORT1- receptor associated protein DED- death ejector domain of FADD/MORT1 TRADD - TNF receptor associated protein Like CARD, DED can be used by FADD to recruit and activate caspase-8 [53,54], in a process that occurs within minutes after receptor DED is shared by FADD/MORT1, caspase-8 and TRADD (TNF receptor associated protein) [52]. Fas-induced apoptotic cascade (on the basis of Cai, J. BBA 1366 (1998) )

TRADD рецептор Fas Активация каспазы 8 после связывания апоптогена с мембранным рецептором 1 Прокаспаза 8 Каспаза 8 DED рецептор TNF FADD/ MORT 1

Апоптоз CD95L CD95 FADD Прокаспаза-8 c-FLIP Bcl-2 Bcl-x L Каспаза-8 1 t -Bid t -Bid Bid 2 3 Прокаспаза-9 Каспаза-9 7 Повреждение ДНК p53 Bax 4 dАТФ AIF Cyt cCyt c Apaf-1 Апоптосома Каскад ферментных реакций Прокаспаза-3 Каспаза-3 8 АПОПТОЗ

Передача апоптозных сигналов (по В. П. Скулачеву) Плазматическая мембрана Лейкоцит Каспаза 3 25 ФС 12 АФК ФС О 13 АФК 1719 ТНФ Рецептор TNF 20 Цит c 2424 Каспаза апоптоз 11 tBid 22 Каспаза Bax 23

Каскад активации апоптоза, инициированный выходом цитохрома c каспаза 9 прокаспаза 9 +dATP 4 5 прокаспаза 3 каспаза 3 6 АПОПТОЗ 8 7 Активация белков- апоптогенов и инактивация ферментов репарации ДНК 1 2 Cyt c 3 Apaf 1

Образование апоптосомы AIF Cyt c Апоптосома dАТФ Apaf-1 6

Каналы в мембранах митохондрий Б А Сигналосома ААА VDAC Цикло- филин D Канал Bax Bcl- 2 Bcl-x L или Bcl- 2 Канал Bax/порин Канал t-Bid

Изменение флуоресценции митохондрий, окрашенных тетрациклином Ф-ХТ - флуоресценция хлортетрациклина СР - светорассеяние O 2 - концентрация кислорода СР СР, 10% 1 min O2O2 Фл ХТ, 10% Suc 31,5 мкА Ca 2+ 12,5 мкА Поглощение Ca 2+ Ф-ХТ Потеря Ca 2+

Матрикс Наружная мембрана VDAC (порин) ЦФ Циклоспорин А Бонгкрековая кислота, АТФ Межмембранное пространство Внутренняя мембрана КК БР ГК Растворенные вещества Пора НП ААА Атрактилозид, Са 2+, Вах, АФК

Конфокальная лазерная микроскопия Фагоциты, вступающие в апоптоз

# Мембранный потенциал в митохондриях живых клеток greenredgreen red

Мембранная фаза апоптоза: связывание прокаспазы 8 CD95 FADD Прокаспаза-8 CD95L

Подготовка к активации митохондрий Каспаза-8 1 t -Bid Bid 2 Проркаспаза-8

Выход цитохрома с из митохондрий 3 Повреждение ДНК p53 Bax 4 t -Bid AIF Cyt c 5 Bcl-x L Bcl-2

Апоптозный каскад реакций каспаз 3 9 Прокаспаза-9 Каспаза-9 7 Каскад ферментных реакций АПОПТОЗ Апоптосома Каспаза-3 Прокаспаза-3 8

Вне -митохондриальная активация апоптоза Каспаза-8 9 Каскад ферментных реакций Прокаспаза-3 Каспаза-3 АПОПТОЗ 8

Апоптоз CD95L CD95 FADD Прокаспаза-8 c-FLIP Bcl-2 Bcl-x L Каспаза-8 1 t -Bid t -Bid Bid 2 3 Прокаспаза-9 Каспаза-9 7 Повреждение ДНК p53 Bax 4 dАТФ AIF Cyt cCyt c Apaf-1 Апоптосома Каскад ферментных реакций Прокаспаза-3 Каспаза-3 8 АПОПТОЗ

Физико-химические основы патологии клетки Российский Государственный Медицинский Университет Московский Государственный Университет Ю. А. Владимиров Москва © 2003 АФК и апоптоз

Морфология нейтрофилов при апоптозе

Апоптоз, вызываемый активными формами кислорода

Рис. 4. Апоптоз CD95L CD95 FADD Прокаспаза-8 c-FLIP Bcl-2 Bcl-x L Каспаза-8 1 t -Bid t -Bid Bid 2 3 Прокаспаза-9 Каспаза-9 7 Повреждение ДНК p53 Bax 4 dАТФ AIF Cyt cCyt c Apaf-1 Апоптосома Каскад ферментных реакций Прокаспаза-3 Каспаза-3 8 АПОПТОЗ

Mitochondrion is a target and a source of injury Mitochondrion Ca 2+ from outside Phospholipase A2 Fe 2+ release Lipid peroxidation Lack of ATP Ca 2+ in cytoplasm Hypoxia Oxydative stress Necrosis Apoptosis Release of Cyt C Matrix swelling

Superoxide manufacturers in the cell 1.NADPH oxidase in plasma membrane 2.Respiratory chain in mitochondria Phagocyte Inner membrane Matrix Inter membrane space I III IV NAD + NADH Q QH 2 2e¯ C e¯ 4H + 2H 2 O O2O2 C II Q QH 2 SuccinateFumarate 2e¯ Mitochondrion

Lucigenin is an adequate CL-probe for superoxide.

NADH is the best substrate for ·O 2 ¯ production.

Kinetic control of superoxide production There are at least two mechanisms regulating the bifurcation of electron fluxes: kinetic and structural. Matrix Intermembrane space I III IV NAD + NADH e¯ e¯ 4H + 2H 2 O O2O2 C II Q QH 2 Succinate e¯ C FAD is a probable bifurcation site C ·O2¯·O2¯ ·O2¯·O2¯ + O 2

FMN NAD(P)H – FMN oxidoreductase NADH oxidase FMN

SQR Cyt b FAD 2Fe-2S 4Fe-4S 3Fe-4S CoQ E. Coli Succinate Dehydrogenase (SQR) is an analog of mammalian respiratory Complex II

Manifestations of mutations in SQR gene in eukaryotes 1.Optic atrophy 2.Tumor formation (paraganglioma, pheochromocytoma ) 3.Myopathy 4.Encephalopathy Clinical phenotypes: These disorders can be caused by oxidative stress produced by complex II P. Rustin, A. Roetig, Biochim. Biophys. Acta 1553, 117 (2002) – a review. T. Bourgeron et al., Nature Genet. 11, 144 (1995). B. E. Baysal et al., Science 287, 848 (2000). S. Niemann, U. MuЁller, Nature Genet. 26, 268(2000).

Метаболизм первичных радикалов. OO¯ Защита LOOH HOOH HClO SOD O 2 + H 2 O 2 2 catalase peroxidases Детоксикация H 2 O 2 4. NO Регуляция 1 Cl¯ миелопероксидаза ClO¯ 3 OONO (пероксинитрит) 5 Повреждение Fe 3+ Fe LO HO Владимиров, А., Три гипотезы о механизме действия лазерного облучения на клетки и организм человека, in Эфферентная медицина, С. Чикин (ред.), 1994, Институт Биомедицинской Химии РАМН: Москва. p Повреждение

Damage to biomembranes resulting from lipid peroxidation Electrical breakdown Increased proton permeability Damage to bioenergetics Increased Ca 2+ permeability Damage by Ca 2+ Human diseases Radicals Membrane lipid layer Damage to barrier function Modification of physical properties Increased viscosity Hindering of enzyme activity Increased polarity Increased LPO promotion by Fe 2+ Growth of surface charge Altered interaction with ions Shrinkage of hydrophobic phase Shifts in cholesterol distribution

How we created and measured the membrane potential in mitochondria? pH Inner mitochondrial membrane generates potential difference ( )and pH difference ( pH) between bathing solutions, in the presence of respiration substrates and oxygen. H + = RT ln[H + ] + zF pH Upon addition of permeable acid (e.g. acetic acid) pH would decrease and hence would increase. The fluorescence probe was used to measure the membrane potential ( ).

Electrical Breakdown in Mitochondria 2 min U (mV) F (r.u.) substrate acetate Being penetrative, acetic acid neutralizes pH on the membrane, so increasing component of the proton-motive force. It is seen in the left part of the figure that potential is stable, as far as it does not exceed 200 mV. substrate acetate If it does, the breakdown take place which leads to a gradual decrease of membrane potential; tan can serve as a measure of the membrane damage by the breakdown.

Dose-effect curves of SH group Radiation dose (J/m ) SH groups (arbitrary units) TBARS (nmole/mg protein) SH TBARS

VDAC HK CK BPR Cph. D Intermembra ne space Inner membrane Outer membrane Matrix Atractulosid e Ca2+, Bax, ROS Циклосполрин А Water solutes Bongkrecic acid, ATP ААА Permeability transition pore

Fig. 6. Damage to Ca 2+ ATPase under lipid peroxidation Ca 2+ ATP ADP Native Ca- ATPase Ca 2+ ATP ADP Damaged ATPase

Са-АТФаза снизу (стерео)

Са-АТФаза Ca 2+ Мембрана

Рис. 5. Роль АФК в апоптозе Матрикс Межмембранное пространство Дыхат. цепь ААА ·OO¯ Ca 2+ PiPi 1 H2O2H2O2 MnSOD 2 H 2 O + O 2 Catalase 3 H2OH2O ГП 2GSHGSSG 4 ГР НАДФ-HНАДФ + 5 НАД-HНАД + H+H+ ТГ 6 HO· PiPi Липопероксидация Fe 2+ 7 Мегаканал (MPT) SH HS 8

Радикалы, клеточная мембрана и апоптоз

Передача апоптозных сигналов (по В. П. Скулачеву) Плазматическая мембрана Каспаза 3 25 ФС 12 АФК ФС О 13 АФК 1719 ТНФ Рецептор TNF 20 Цит c 2424 Каспаза апоптоз 11 tBid 22 Каспаза Bax 23 Лейкоцит Митохондрия

Protein transfection domain (KLAKLAK) 2 + cyt + cyt + cyt + cyt + cyt + cyt + cyt + cyt - -- Inner leaflet PS Scrambrase - APT - + cyt + cyt Apoptosome Caspase cascade PS Recognition by macrophage PS oxidation + cyt + cyt H 2 O 2 ROS + cyt + cyt + cyt + cyt + cyt + cyt H 2 O 2 ROS Disruption of Mitochondria DP-1-Induced Disruption of Mitochondria and Release of Cytochrome c Causes PS Oxidation

Antioxidants (vitamin E, GSH) SOD Catalase MACROPHAGE PS PS ox PS-R PSox-R Recognition of PS and PSox by macrophage receptors CASPASES PS APT SCRAMBLASE Cyt c AIF H 2 O 2 ROS Cyt c AIF FAS H 2 O 2 ROS PMT PS ox Externalization of PS and PSox PS Oxidation Role of Macrophages in Apoptosis