ГЕНЕТИКА ИНДИВИДУАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ МНОГОКЛЕТОЧНЫХ ОРГАНИЗМОВ 1. Стабильность генетического материала в онтогенезе 2. Тотипотентность ядра соматической клетки 3. Дифференциальная активность генов 4. Морфогенетические поля. 5. Гомеозисные мутации и гены 6. Как действуют гомеозисные гены.
Развитие многоклеточных организмов состоит из трёх взаимосвязанных процессов, протекающих одновременно: 1. Роста (накопления клеточной массы), происходящего путём митоза; 2. Дифференцировки генетически идентичных клеток в различающиеся по своим свойствам ткани; 3. Формирования из генетически и анатомически одинаковых наборов тканей различных органов (органогенеза). Изучение этих процессов требует получения ответа на следующие фундаментальные вопросы: 1. Что происходит с генетическим материалом при дифференцировке клеток? 2. Какие механизмы управляют дифференцировкой? 3. Каковы механизмы органогенеза?
СТАБИЛЬНОСТЬ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА В ОНТОГЕНЕЗЕ. 2.ТОТИПОТЕНТНОСТЬ ЯДРА ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОЙ КЛЕТКИ 1. Прямое доказательство того, что ядра некоторых дифференци- рованных клеток животных содержат генетическую информацию о всём организме, получено в эксперименах Дж. Гёрдона на лягушке Xenopus laevis (рис.1). Успешное клонирование млекопитающих, осуществлённое в конце 20 века подтверждает это положение. Этот вывод справедлив и для растений.. Растения моркови могут быть получены из отдельных клеток флоэмы корнеплода, а также регенерировать из клеток каллуса, возникшего на отрезках стебля проростков, семядолей и т. д. Следовательно, дробление и последующая дифференцировка не сопровождаются потерей или необратимыми изменениями ядерного материала.
Рис. 1. Схема опыта Дж. Гёрдона, иллюстрирующая тотипотентность ядра дифференцированной клетки (эпителия кишечника)головастика лягушки Xenopus laevis Развитие взрослой особи из яйцеклетки, ядро которой заменено ядром из соматической клетки кишечного эпителия головастика 1 неоплодотворенное яйцо, 2 УФ-облучение, 3 головастик, 4 кишечник головастика, 5 клетки кишечного эпителия, 6 микропипетка, 7ядро эпителиальной клетки, 8 яйцо реципиент, 9 бластула, 10 неделящаяся клетка 11ненормальный эмбрион, 12взрослая лягушка
Словарь терминов Детерминация клетки – процесс получения клеткой программы дальнейшего развития. При этом по внешним признакам детерминированная клетка не отличима от других окружающих клеток. Детерминация всегда полностью обратима. Дифференцировка – процесс приобретения клеткой признаков и свойств, согласно полученной программы развития. Дифференцировка животных клеток, как правило, не обратима. Тотипотентность – свойство ядер дифференцированных соматических клеток обеспечивать полное развитие организма.
Дифференциальная экспрессия генов, т. е. регуляция их активности может происходить на уровне любого известного матричного процесса; репликации, транскрипции, трансляции, а также в процессе созревания иРНК и полипептидных цепей, образующихся в результате трансляции. Яркий пример дифференциальной транскрипции связан с образованием так называемых пуфов или колец Бальбиани в гигантских хромосомах двукрылых. Пуфы это характерные вздутия определенных дисков политенных хромосом, образующиеся в результате локальной декомпактизации в них ДНК (рис.2, 3). В пуфах происходит активная транскрипция, на что указывает интенсивное включение Н 3 -уридина в районе пуфа на препаратах политенных хромосом. 3. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ГЕНОВ
Рис.2. Трансплантация слюнных желёз между личинками D.melanogaster A пуфы в третьей хромосоме личинок разных возрастов (13). Справа номера дисков на цитологической карте. Б трансплантация слюнной железы из более старой в молодую личинку и сравнение характера пуфирования «своих» и «чужих» хромосом при после- дующем развитии
Рис.3. Изменение характера пуфирования в хромосоме D. melanogaster в результате пересадки слюнных желёз от более «старых» более молодым личинкам. Пуфирование тех или иных дисков характерно для каждой стадии развития личинки. Образование и исчезновение пуфов регули- рует внутренняя среда орга- низма в соответствии со стадией развития. Если слюнные железы личинки дрозофилы пересаживать бо- лее молодым или более старым личинкам, то кар- тина распределения пуфов меняется в соответствии с той, которая характерна для возраста реципиента.
Одним из важных регуляторов образования пуфов и, следовательно, дифференциальной транскрипции генов у насекомых являются стероидные гормоны, в частности гормон линьки экдизон. Показано также влияние белков, синтезированных более ранними пуфами, на развитие более поздних пуфов. Изменение структуры хроматина, его декомпактизация, наблюдаемая при образовании пуфов, также является одним из условий, обеспечивающих дифференциальную активность генов. В 80-х гг. ХХ века удалось расшифровать некоторые механизмы, управляющие процессом онтогенеза. Обнару- жены гены, определяющие выбор пути развития. Ключевую роль играет семейство генов, которые называются гомеозисными. Гомеозисные гены контролируют подразде- ление раннего эмбриона на клеточные поля, которые разви- ваются в определенные ткани и органы.
У южно-африканской шпорцевой лягушки Xenopus 1аеvis самки могут в любое время года откладывать по 1500 крупных яиц, которые легко оплодотворяются. После оплодотворения яйцеклетка лягушки делится. Клетки делятся синхронно каждые 30 мин до тех пор, пока их число не достигнет 4 тыс. На этой стадии, называемой средней бластулой, эмбрион имеет форму полой сферы. Все клетки внешне одинаковы, однако судьба многих из них, расположенных в области экватора бластулы, уже предопределена они станут слоем клеток, называемый мезодермой. Развитие нервной системы из эктодермы происходит в ответ на химические сигналы, поступающие из подлежащей мезодермы. Эти сигналы индуцируют утолщение части эктодермы с образованием структуры, называемой нервной пластинкой. (Эта стадия эмбрионального развития называется нейрулой). Затем края нервной пластинки сближаются друг с другом, а ее середина погружается в тело эмбриона. В конце концов, края сливаются, и образуется нервная трубка, которая служит основой головного и спинного мозга.
МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОЛЯ В 1918 г. Р. Харрисон (США) показал, что эмбриональные клетки детерминируются по пути образования анатомических структур вскоре после завершения гастуляции. Он пересаживал кусочки боковых участков мезодермы из одних нейрул в другие. Если трансплантат был взят из определенной области тела нейрулы-донора, то у реципиента из него всегда развивалась дополнительная передняя конечность. Харрисон сделал вывод: внешне неотличимые клетки мезодермы у эмбрионов уже каким-то образом «знают», какой части тела они принадлежат. Выбор клеткой пути развития, когда внешне она не отличается от других клеток, называется детерминацией. Если удалить у эмбриона всю мезодерму, которая в норме образует переднюю конечность, то конечность все-таки может вырасти. Харрисон предположил, что окружающая область мезодермы также обладает потенциальной способностью индуцировать и обеспечивать рост конечности. Такие широкие участки, потенциально способные к формированию определенных структур, получили название морфогенетических полей. Многие эксперименты по трансплантации на эмбрионах амфибий показали, что именно мезодерма определяет, какой конец эмбриона станет головой, а какой хвостом. Была составлена карта мезодермы нейрулы амфибий, т.е. ее разделение на морфогенетические поля, соответствующие ряду органов жабрам, ушам, передним конечностям, задним конечностям, хвосту и т. д.д. В пределах морфогенетического поля способность к образованию органа постепенно изменяется. Возникло предположение, что каждое морфогенетическое поле содержит градиент информации, определяющей развитие органа. Действие этих градиентов тесно связано с характером экспрессии определенных наборов генов.
ГОМЕОЗИСНЫЕ МУТАЦИИ И ГЕНЫ В 1948 г. Э. Льюис (США) из Калифорнийского технологического института начал анализ гомеозисных мутаций у плодовой мушки Drosophila melanogaster. При гомеозисных мутациях вместо той или иной части тела возникает структура, которая в норме располагается в другом месте. Например, мухи с мутацией bithorax вместо одной пары крыльев имеют две (рис.4); у мутантов Antennapedia на месте антенн растет дополнительная пара ног (рис. 5). Льюис установил, что такие аномалии обусловлены мутацией в одном гене, хотя для развития ноги или крыла требуется активность сотен генов. Родилась гипотеза, что такие мутации затрагивают регуляторные гены, которые управляют деятельностью большого числа подчиненных им генов.
Рис. 4. Мутант bithorax (самец дро-зофилы), у которого метаторакс полно-стью превращён в мезаторакс и вместо одной имеется две пары крыльев. (Айала, Кайгер, 1988) Рис. 5. Голова нормальной мухи (А) и мухи с гомеозисной мутацией Antennapedia (Б). (Альбертс и др.1987).
В начале 80-х годов методами Д. Хогнесс и У. Бендер выделили гены Ultrabithorax, Abdominal-A и Abdominal-B из комплекса Bithorax. В. Геринг, Р. Гарбер, М. Скотт и Т. Кауфман выделили гены комплекса Апtennapedia. В 1983 г. Геринг и У. Макгиннис обнаружили, что ген Antennapedia содержит последовательность ДНК, которая име- ется и в других генах из управляющих развитием. (Если в разных генах встречаются сходные последовательности, их называют консервативными). Консервативные последовательности ДНК способны гибри- дизоваться друг с другом. Можно пометить радиоактивным изотопом консервативную последовательность гена, например Antennapedia, и использовать ее в качестве зонда для обнаруже- ния других генов, содержащих сходные участки. Таким спосо- бом были обнаружены многие гомеозисные гены у дрозофилы. У других беспозвоночных многоножек и земляных червей, от которых произошли насекомые, тоже есть этот консер- вативный участок ДНК. Очевидно, молекулярная структура всех генов, управляющих эмбриональным развитием, сходна.
Рис. 6. А – строение белков - продуктов гомеозисных генов. Гомеодо- мен – состоит из 60 аминокислотных остатков. Он почти одинаков по составу у всех изученных гомеозисных белков. Именно он связы- вается с ДНК и регулирует экспрессию подчинённых генов. Левее находится короткий шарнирный участок. Затем – вариабельный участок, которым отличаются разные гены друг от друга. Б – гомеодомен содержит четыре спиральных участка, один из которых (серый) узнаёт специфическую последовательность ДНК в гене мишени и связывается с ней. Были обнаружены такие гены и у человека.
Консервативный участок в гомеозисных генах получил назва- ние гомеобокс. Гомеобокс кодирует последовательность из 60 ами- нокислот, которая очень сходна у белков продуктов большинства гомеозисных генов. В составе белка эта последовательность назы- вается гомеодоменом. Его функция заключается в том, чтобы узнавать специфические последовательности в генах, которые регулируются гомеозисными генами, и связываться с ними. Используя ДНК-зонд, содержащий гомеобокс дрозофилы, из ДНК лягушки был выделен ген, подобный гену Antennapedia,. В нукле- отидной последовательности этого гена лягушки обнаружилось, что в нем имеется гомеобокс. То есть, в ДНК лягушки имеется такой же ген, что у насекомых и многоножек. У эволюционно далеких друг от друга животных, гомеозисные гены оказались структурно сходными. Хотя гомеодомены белков, кодируемых разными гомеозисными генами, структурно близки, их можно идентифицировать по характерным различиям в аминокислотных последовательностях. Некоторые гомеодомены похожи друг на друга гораздо больше, чем другие. Любопытно, что обнаружилось большое сходство ряда гомеодоменов млекопитающих и дрозофилы (7).
Рис. 7. Аминокислотные последовательности гомеодоме- нов четырёх гомеозисных генов дрозофилы (верхние ря- ды в каждой цветной полосе) и мыши (нижние ряды). Самая верхняя последовательность на белом фоне – обоб- щённая последовательность всех гомеодоменов. Чёрточ- ки обозначают, что в данном положении аминокислота такая же, что и в обобщённой последовательности.
В 1988 г. были выделены белки, регулирующие транскрип- цию. Эти белки усиливают экспрессию определенных генов-ми- шеней. Выяснилось, что некоторые из них содержат гомеодо- мен, а значит, являются продуктами генов, содержащих гоме- обокс. Эти исследования независимо подтверждили, что гены, содержащие гомеобокс, регулируют активность других генов. Исследование участков тела эмбриона, в которых присутству- ют белки, кодируемые гомеозисными генами, показало, что у эмбриона Xenopus один из этих белков (XL1) сосредоточен в узкой полоске клеток непосредственно позади головы (рис. 8). Эта полоска включает в себя мезодермальные клетки, переднюю часть спинного мозга, а также нервный гребень. В этих тканях наблюдаются очень ровные параллельные передняя и задняя границы области экспрессии гена XL1. Так как мезодерма опре- деляет передне-заднюю поляризацию нервной ткани, можно предположить, что мезодерма, в которой экспрессируется ген XL1 индуцирует его экспрессию в лежащей над ней нервной пластинке.
Рис. 8. Молекулы белка, продукта гомеозисного гена XL1, сосредоточены в дискретном слое, расположенном в определённом месте тела эмбриона. Этот белок обнаруживается в ядрах клеток мезодермы (синяя) и эктодермы (красная). (Робертис и др. 1990)
В других частях эмбриона активны другие гомеозисные гены. По распределению экспрессии гомеозисных генов эмбрион в передне-заднем направлении подразделяется на клеточные поля, различающиеся по своим потенциям. Такое подразделение предшествует образованию специализиро- ванных структур и органов. как у позвоночных, так и у беспозвоночных. Гомеозисные гены расположены в хромосоме кластерами, т. е. группами. Причём, в хромосомной ДНК гомеозисные гены расположены в определенном порядке слева направо. У мыши порядок расположения гомеозисных генов в кластере в точности соответствует относительному распределению их экспрессии в эмбрионе. Гомеозисные гены, находящиеся у левого конца комплекса, экспрессируются в задней части тела, а гены, занимающие правый конец, ближе к голове (рис.9).
Рис. 9. Расположение в ДНК родственных гомеозисных генов у дрозофилы и мыши. Расположение генов в хромосоме коррелирует с расположением участков тела, в которых они экспрессируются (соответствующие гены и участки тела соединены стрелками). Чем правее на хромосоме расположен ген, тем ближе к головному концу он экспрессируется. (Робертис и др. 1990)
Все позвоночные имеют по четыре комплекса гомеозисных генов, находящиеся в разных хромосомах. Вероятно, в ходе эволюции эти комплексы возникли в результате дупликаций единственного кластера гомеозисных генов, какой свойствен беспозвоночным. Поэтому у человека есть, например, четыре гена, сходных с геном Abdominal-B дрозофилы, и четыре гена, подобных гену Deformed.
КАК ДЕЙСТВУЮТ ГОМЕОЗИСНЫЕ ГЕНЫ? Постепенно накапливаются данные о том, каким образом обеспечивается последовательное действие гомеозисных генов. У позвоночных вероятными кандидатами на роль таких позиционных регуляторов являются ретиноевая кислота (это соединение, родственное витамину А, иногда вызывает тяжелые врожденные уродства) и белковые факторы роста. Возможно, они передают соответствующую информацию, избирательно активируя гомеозисные гены в мезодерме, играющей ключевую роль в становлении плана строения тела. Добавление ретиноевой кислоты к культурам эмбриональных клеток показало, что это вещество может активировать многие гомеозисные гены.
Как действуют активированные гомеозисные гены определяют ли они судьбу эмбриональных клеток, а тем самым форму тела и образование органов непосредственно или же их влияние осуществляется опосредованно? Результаты двух экспериментов указывают на то, что действие этих генов является непосредственным. Как действуют активированные гомеозисные гены определяют ли они судьбу эмбриональных клеток, а тем самым форму тела и образование органов непосредственно или же их влияние осуществляется опосредованно? Результаты двух экспериментов указывают на то, что действие этих генов является непосредственным. В одном эксперименте в одноклеточные эмбрионы Xenopus вводили антитела против белка XL1. Антитела связывались с этим белком и инактивировали его в то время, когда определяется план строения тела. У головастиков, выросших из таких эмбрионов, ткани, которые входят в состав передней части спинного мозга, оказались в заднем отделе головного мозга (рис 10). Таким образом, «потеря функции» гена XL1 привела к тому, что часть спинного мозга превратилась в структуру, расположенную ближе к переднему концу тела. В одном эксперименте в одноклеточные эмбрионы Xenopus вводили антитела против белка XL1. Антитела связывались с этим белком и инактивировали его в то время, когда определяется план строения тела. У головастиков, выросших из таких эмбрионов, ткани, которые входят в состав передней части спинного мозга, оказались в заднем отделе головного мозга (рис 10). Таким образом, «потеря функции» гена XL1 привела к тому, что часть спинного мозга превратилась в структуру, расположенную ближе к переднему концу тела.
XL1 нарушает развитие головастика. В норме (слева) белок XL1 синтезируется в определённом участке передней части спинного мозга (синий). Если в одноклеточный эмбрион ввести антитела против этого белка, то у выросшего головастика (справа) этот участок превращается в задний отдел головного мозга (красный). Рис. 10. Ингибирование активности гомеозисного белка XL1 нарушает развитие головастика. В норме (слева) белок XL1 синтезируется в определённом участке передней части спинного мозга (синий). Если в одноклеточный эмбрион ввести антитела против этого белка, то у выросшего головастика (справа) этот участок превращается в задний отдел головного мозга (красный).
В другом эксперименте в эмбрионы мыши вводили фрагмент ДНК, содержащий гомеозисный ген. Фрагмент был скон- струирован так, что гомеозисный ген в его составе экс- прессировался по всему телу, даже в тех участках, где в норме он не активен, например, в области головы и шеи. У родившихся мышей возникали тяжелые дефекты головы, например «волчья пасть». У них имелись также дополнительный позвонок и межпозвоночный диск у основания черепа и дополнительная пара ребер в шейном отделе позвоночника. Неуправляемая экспрессия гомеозисного гена обусловила гомеозисные трансформации, подобные тем, которые наблюдаются при мутациях аналогичных генов у дрозофилы. Другие исследования показали, что гомеозисные гены играют роль в определении судьбы клеток. На ранних стадиях развития гомеозисные гены интенсивно экспрессируются в слоях вдоль передне-задней оси тела (рис. 8). Позже, когда в таких зонах формируются органы, интенсивная экспрессия тех же гомеозисных генов возобновляется. На этих более поздних стадиях гомеозисные гены, по-видимому, создают своего рода молекулярные сигналы, «напоминая» клеткам, из какой части эмбриона они происходят.
Например, передняя конечность образуется из полоски мезодермы, в которой экспрессируется ген XL1. Клетки этой полоски пролиферируют и образуют маленькую почку передней конечности, которая появляется у Xenopus к третьей неделе после оплодотворения. На этой стадии мезодерма почки передней конечности внешне гомогенна, однако в ней имеется градиент белка XL1: его концентрация наибольшая в ядрах клеток, расположенных вдоль передней стороны почки конечности, из которой развивается большой палец, и наименьшая в ядрах клеток вдоль задней стороны, из которой развивается самый маленький палец. По мере роста и формирования конечности концентрация белка XL1 поддерживается наибольшей в области плеча. А продукт другого гомеозисного гена, белок Нох5.2, образует противоположно направленный градиент: его концентрация наибольшая на задней стороне и у дистального конца конечности.
Градиенты белков XL1 и Нох5.2 наблюдаются у эмбрионов лягушки, курицы и мыши. Найдены еще три гомеозисных гена, расположенных в хромосоме рядом с геном Нох 5.2, которые активируются последовательно по мере удлинения конечности. Порядок активации этих генов соответствует их расположению в ДНК. Градиенты белков или других веществ могут служить сигналами для определения положения клеток и направления их развития. Например, в почке конечности клетки образуют раздельные пальцы, возможно, по-разному реагируя на различные концентрации одного и того же белка. Такой механизм гораздо экономнее, чем, если бы каждый палец определялся отдельным белком.
Анализ градиентов гомеозисных белков показал, что тот же самый набор гомеозисных генов, который определяет продольную ось тела, позже задает положение клеток в ходе развития конечностей. Белки, содержащие гомеодомен, обнаруживаются в ядрах клеток, что и следовало ожидать для белков, связывающихся с ДНК, которые «включают» и «выключают» гены. Каким образом в почках конечностей устанавли- ваются градиенты ядерных белков, остается неясным. Возможно, в этом участвуют сигналы межклеточного взаимодействия, подобные тем, что используются при установлении продольной оси тела; их передача осуществляется, вероятно, при участии ретиноевой кислоты или факторов роста.
ВЫВОДЫ 1. Форма тела определяется семейством родственных генов. Под их действием тело эмбриона подразделяется вдоль передне- задней оси на клеточные поля, которые превращают-ся в конечности и другие структуры взрослого организма. 2. Особенностью строения гомеозисных генов является наличие консервативного участка, кодирующего гомеодомен из 60 аминокислот, и вариабельного. 3. Консервативные участки гомеозисных генов даже эволюционно далёких организмов, имеют сходные последовательности ДНК – гомеобокс. 4. Гомеозисные гены у всех организмов расположены кластерами, причем в той же последовательности, что и управляемые ими зоны развития тела. 5. В регуляции органогенеза большое значение имеют градиенты концентрации белков - морфогенов, закодиро-ванных в гомеозисных генах.