Вторичная структура белков PEPTOCOCCUS AEROGENES FERREDOXIN HORMONE GLUCAGON HYDROLASE (SERINE PROTEINASE )

Первичная структура может свернуться в пространстве и принять ту или иную пространственную структуру, которая называется вторичной структурой. Вторичная структура (1)Возможности относительно свободного вращения вокруг некоторых связей (2) Возможности взаимодействий между близкими по цепи, но ковалентно несвязанными атомами

. Образование водородных связей (показаны стрелками) В принципе, возможны такие спирали, стянутые Н-связями: 2 7, 3 10, 4 13 (обычно именуемая ), 5 16 (или ). В названии "2 7 " - "2" означает связь со 2-м по цепи остатком, а "7" - число атомов в цикле (O......H-N-C'-C -N-C'), замыкаемом этой связью.

Правые (R) спирали Левые (L) спирали Показан отсчет положительного угла: близкая к нам стрелка вращается против хода часов

(б) Схематическое изображение одного витка -спирали, вид с торца. Стрелка показывает поворот спирали (в расчете на один остаток) по мере ее приближения. а) Атомарная структура. R - боковые группы. Голубые линии - водородные связи Правая -спираль

Карта разрешенных и запрещенных значений углов для всех гипотетически возможных спиралей полипептидной цепи: 2 7, 3 10, 4 13 ( ), 5 16 ( ), правые (R) и левые (L).

Модель -спиральной конформации полипептидной цепи. -спираль -спираль Водородные связи формируются «параллельно» направлению полипептидного остова вдоль оси спирали!

Параметры -спирали: 1. 3,6 аминокислотных остатков на виток спирали 2.Шаг спирали Р = 5.4Å 3. Трансляция на один виток d = 1,5Å 4.Радиус спирали r = 2,3Å 5. Водородные связи образуются между 1 и 4 пептидными группами

6. = -57 о, = -47 о Параметры -спирали

-структура -структура Водородных связей в -структуре – «перпендикулярно» направлению полипептидного остова. Антипараллельная Параллельная

-структуры: Характеристики -структуры: 6 полипептидных цепей 6 аминокислотных остатков в цепи 6 полипептидных цепей 6 аминокислотных остатков в цепи

t d Длина листа (6 остатков) d =20 Å Ширина листа (6 цепей) t =25Å Характеристики -структуры: -структуры:

-структуры: Характеристики -структуры: Антипараллельные = -139 о = -139 о, = +135 о параллельные = -119 о = -119 о, = +113 о

-лист складчатый -лист скрученный -листы скручены из-за того, что скручены отдельные -тяжи Скрученность отдельного -тяжа - левая (у L аминокислот), боковые группы тяжа поворачиваются по часовой стрелке (на -165 o на каждый остаток) по мере приближения тяжа. Боковые группы расположены на складках; каждая обращена в ту же, что и складка, сторону, т.е. направленные вниз и вверх боковые группы чередуются вдоль -тяжа.

Конформация идеальной (не скрученной) параллельной и антипараллельной -структуры для поли(Gly), и усредненная конформация реальной (сложенной из L аминокислот) скрученной (twist) -структуры. Скрученность -листа Пунктир показывает область энергетического минимума для отдельно взятого остатка Ala; контуром показаны границы области разрешенных конформаций этого остатка. Диагональ -карты соответствует плоской периодичной структуре, имеющей 2 остатка на виток (n=2). Над диагональю лежат левые (L) спирали, под ней - правые (R).

- изгибы - изгибы Конформация -изгибов типа I (а) и II (б)

- изгибы - изгибы Конформация -изгибов типа I (а) и типа II (б)

Третий тип спирали – пролиновые спирали: полипролин I и полипролин II. Пролиновые спирали

Первая – полипролин I - левая спираль, содержит 10 остатка на 3 витка; все пептидные связи в цис- конформации. Вторая – полипролин II - левая спираль, содержит 3 остатка на виток; пептидные связи в транс-положении. Спираль полипролин II имеет более вытянутую цепь, чем -спираль: смещение вдоль оси спирали 3.12 Å на остаток по сравнению с 1.5 Å для -спирали. В нормальных физиологических условиях спираль полипролин II более стабильна.

Основные геометрические параметры наиболее распространенных в белках вторичных структур Структура H-связьОстаток/ виток Смещение/ остаток (Å) Спираль R (4 13 ) R CO 0 HN Спираль (3 10 ) R CO 0 HN Лист -паралл. меж цепей * Лист - анти меж цепей * Спираль Poly(Pro) IIнет

для пролина для аланина для больших остатков P Карты Рамачандрана для наиболее распространенных в белках вторичных структур

Экспериментальное определение вторичной структуры белков Спираль ввиду ее симметрии легко распознать и описать. На карте электронной плотности, полученной методом РСА, спирали видны как светлые круги (вид с торца) или как периодически расположенные светлые пятна (вид спирали сбоку). Метод РСА (ренгено- структурный анализ)

Сближенность ядер атомов Н, наиболее характерная для ЯМР ядерный магнитный резонанс антипараллельной -структуры параллельной -структуры -спирали

Экспериментальное определение вторичной структуры белков Для полилизина в форме -спирали (a), -структуры (b) и неупорядоченного клубка (r). Спектры КД ИК-спектры пропускания в тяжелой воде (D 2 O)

Стабильность вторичной структуры белков и кинетика ее образования

α-спирали следующая водородная связь, (СО) 1 …(HN) 5, дополнительно фиксирует конформацию еще одного остатка - остатка 4 ; связь (СО) 2 … (HN) 6 дополнительно фиксирует остаток 5, и т.д. Таким образом, если в спирали фиксировано n остатков, то их фиксирует n-2 водородные связи Первая водородная связь в α-спирали, (СО) 0 …(HN) 4, фиксирует конформации трех остатков - 1, 2, 3;

F = F F клуб. = (n-2)f H nTS = -2f H + n(f H TS ) Свободная энергия образования α-спирали из клубка в водном окружении f H - свободная энергия водородной связи в α-спирали; и энергия, и энтропия перестроек водородных связей в водном окружении, S - потеря энтропии при фиксации одного остатка в спирали. В F есть два члена. (1) -2f H - не зависит от длины спирали; f INIT = -2f H - свободная энергия инициации спирали; f INIT - суммарная свободная энергия обеих границ спирали с клубком учитывает и инициацию, и терминацию спирали. (2 ) n(f H - TS ) - прямо пропорционален длине спирали. f EL = (f H - TS ) - свободная энергия элонгации спирали на 1 остаток. В общем виде, F = f INIT + n. f EL

Отношение вероятности спирального состояния цепи из n остатков к ее клубковому состоянию, равно exp(- F /kT) = exp(-f INIT /kT). [exp(-f EL /kT)] n = s n s = exp(-f EL /kT) - фактор элонгации спирали: s = exp(-f EL /kT); = exp(-f INIT /kT) - фактор инициации спирали: = exp(-f INIT /kT);

Как образуется спираль при изменении условий среды (температуры, растворителя и т.д.): переходом "все-или-ничего" или постепенно?

Теорема Ландау: В системе, где обе фазы одномерны, фазовый переход первого рода невозможен «Одномерность» - это значит, что размер границы, "стыка" фаз не зависит от размера фрагментов этих фаз. В этом смысле и спираль, и клубок в полимере одномерны.

«Происходит как фазовый переход первого рода". Это значит, что при температуре перехода стабильной может быть либо одна, либо другая фаза, но перемешивание фаз (например, льда и воды) ведет к повышению свободной энергии, и потому нестабильно.

Выгодно ли сосуществование фаз в трехмерной системе? Нет. Почему? Рассмотрим температуру, где безграничная вода и безграничный лед имеют равную свободную энергию – это условие "точки перехода". Если в воде плавает льдина из n молекул, свободная энергия границы пропорциональна n 2/3, где n 2/3 - характерное число пограничных молекул, > 0 - энергия границы в расчете на одну из пограничных молекул. Если < 0, "перемешивание" (оно в этом случае термодинамически выгодно) произойдет на молекулярных масштабах, и двух фаз вообще не будет.

Поверхность льдинки повышает свободную энергию на n 2/3. Позиционная энтропия льдинки ( она может находиться в разных точках сосуда ) не превосходит величину порядка k. ln(N), если в сосуде N молекул - N точек, с которых может начинаться льдинка. F [ n 2/3 - kТ. ln(N)] (cвободная энергия льдинки) Логарифм медленно растет для больших N. Если льдинка занимает заметную часть сосуда ( n ~ N/10), то ln(N) (23) мал по сравнению с (N/10) 2/3, то есть в F доминирует граничный член n 2/3, а он противится ее образованию. В трехмерной системе макроскопические фазы разделяются, и фазовый переход первого рода в ней возможен

Выгодно ли сосуществование фаз в одномерной системе? Оказывается, да. Рассмотрим температуру "середины перехода", где спираль и клубок имеют равную свободную энергию, т.е. f EL =0. Свободная энергия обеих границ спирали и клубка, f INIT, не зависит ни от размера спирали, ни от размера клубка. Позиционная энтропия спирали длины n в цепи длины N равна S = k. ln(N-n) и свободная энергия этой спирали F hel f INIT - kТ. ln(N-n)

При больших N член с ln(N-n) всегда доминирует в выражении F hel = f INIT - kТ. ln(N-n) даже если n ~ 0.9 N Логарифмический член ln(N-n) понижает свободную энергию и способствует внедрению спирали в клубок (и, точно так же, - клубка в спираль). Поэтому в одномерной системе фазы не разделяются, они стремятся перемешаться и фазовый переход первого рода, или типа "все-или-ничего", невозможен при достаточно большой длине цепи. Теорема Ландау доказана.

Для большинства аминокислот f INIT 4 ккал/моль, и 0.001, n 0 ~ 30. Для измерения влияния отдельных аминокислотных остатков на стабильность спиралей используют короткие (длиной n 0 ~ 30 или менее) полипептиды. В них может образоваться только одна спираль, и оценить влияние каждой аминокислотной замены на спиральность здесь наиболее просто.

Вклад аминокислотного остатка в стабильность спирали лежит в следующих пределах: аланин - самый "спиралеобразующий" остаток: f EL -0.4 ккал/моль, т.е. s 2; глицин - самый "спиралеразрушающий" остаток: f EL +1 ккал/моль, т.е. s 0.2; пролин - иминокислота (не имеющей NH группы, которая должна завязывать структурообразующую водородную связь в α-спирали) величина s , но точно не измерена.

Это пример не фазового, а кооперативного перехода: при малой величине фактора инициации спирали (

Рассмотрим скорость образования вторичной структуры в пептидах Такой барьер похож на активационный барьер в химических реакциях, только в этом случае он имеет и энергетическую, и энтропийную составляющие. "Медленность" процессов связана с преодолением высокого свободно-энергетического барьера. Особенно это типично для переходов типа "все или ничего", где свободно-энергетический барьер разделяет две фазы и он всегда значителен. Преодоление свободно-энергетического (активационного) барьера # при переходе из состояния "А" в состояние "В". F # - свободная энергия барьера - перехoдного состояния. Кинетика

α-спирали образуются быстро: за наносекунды (10 -9 с) α-спираль охватывает пептид из остатков, т.е. спирали нарастают со скоростью порядка 1 остаток за несколько наносекунд. Скорость образования α-спирали зависит от скорости, с которой она нарастает, и от скорости, с которой в цепях появляются первые зародыши спиральной структуры. Инициация α-спирали требует преодоления активационного барьера, поэтому для образования первого витка спирали необходимо больше времени, чем ее последующее удлинение еще на 1 виток. Т.е. элонгация α-спирали идет быстро, а все наблюдаемое время тратится на ее инициацию.

Характерная зависимость свободной энергии спирали ( F a ) от числа вовлеченных в нее аминокислотных остатков (N) при разных свободных энергиях ее элонгации (f EL ). При f EL 0 - спираль любой длины нестабильна и, следовательно, не образуется.

Кинетика образования α-спиралей относительно проста: они всегда образуются быстро. Кинетика образования -структуры много сложнее и интереснее. -структура в полипептидах часто образуется очень медленно – и за часы, и за недели (но и за миллисекунду). Почему? Белки с -структурой сворачиваются не медленнее α- спиральных белков. Как они успевают? И что отвечает за аномалии в образовании -структуры в полипептидах: медленная инициация или медленная элонгация? "Аномальная" (по сравнению с переходом спираль- клубок) кинетика образования -структуры связана с тем, что она - двумерный объект, а не одномерный, как спираль или клубок.

Схема -листа. Аминокислотные остатки внутренних - участков - черные кружки, краевых -участков - пустые кружки; изгибы (или петли), соединяющие -участки, - уголки. Сценарий роста -листа. Самая нестабильная структура помечена #. Край -листа сложен из краевых -тяжей и изгибов (петель), соединяющих все -тяжи. б

Находящиеся на краю листа звенья цепи имеют меньше контактов с другими, чем внутренние звенья листа. Т.е., край -листа (как и граница другой фазы - капли воды, льдинки или α-спирали) имеет повышенную свободную энергию. В отличие от α-спирали (и в сходстве с каплей) -лист не одномерен, размер его края (и его свободная энергия) растет с числом вовлеченных в лист звеньев цепи. Поэтому переход клубок - -структура фазовый переход первого рода, как образование капли или льдинки. В результате на пути образования -листа возникает высокий (особенно при образовании лишь слегка стабильной -структуры) свободно-энергетический барьер, который во много раз замедляет инициацию его сворачивания.

Пусть свободная энергия клубка принята за 0 (начало отсчета), тогда f - свободная энергия остатка в центре -листа, f + f - свободная энергия остатка на его краю ( f - краевой эффект), U - свободная энергия изгиба. Если -лист образуется, то он стабилен ( f 0 и U > 0 ). Край -листа сложен из (а) краевых -тяжей, и (б) изгибов или петель, соединяющих все -тяжи. а б б б а

В кинетике образования -структуры надо различать два случая: 1) f + f

Образование и последующее "прорастание" зародыша новой фазы - характерная особенность фазовых переходов первого рода, к которым относится образование -структуры. 2) f + f >0 т.е. -шпилька сама по себе нестабильна, и только прилипание к инициирующей -шпильке последующих -тяжей стабилизует -лист. Активационному барьеру тогда соответствует образование "зародыша" - такого -листа или -шпильки, что дальнейший рост листа пойдет уже с общим понижением свободной энергии. а б б б а Но преодоление связанного с образованием зародыша активационного барьера может быть очень медленным

Рассмотрим простейший сценарий роста стабильного -листа: образование инициирующей -шпильки из изгиба и двух -тяжей, по N звеньев (аминокислот) в каждом; образование последующего изгиба на ее конце; прилипание к листу -тяжа из N звеньев; образование последующего изгиба; прилипание -тяжа; и т. д. Цикл "прилипание нового -тяжа и образование нового -изгиба" изменяет суммарную свободную энергию на Nf +U. В результате такого цикла свободная энергия должна снижаться (тогда сворачивание цепи идет быстро), и прилипающий -тяж (и тот, к которому он прилипает) должен состоять не менее чем из N min = U/(-f ) звеньев.

«Переходным» - самым нестабильным состоянием при образовании -структуры - это -шпилька с последующим изгибом (#). Так как стабильность шпильки падает с удлинением, а -тяж в инициирующей шпильке должен состоять как минимум из N min звеньев N min = U/(-f ), то F min инициирующей -шпильки равна F # = U + 2N min (f + f ) + U = 2(U f )/(- f ). Это свободная энергия переходного состояния при образовании -листа по нашему сценарию. f - свободная энергия остатка в центре -листа, U - свободная энергия изгиба. f + f - свободная энергия остатка на его краю ( f - краевой эффект),

Как меняется минимальная свободная энергия -листа с его увеличением? Пока лист мал, доминируют краевые эффекты, и свободная энергия повышается. В большом листе доминируют внутренние остатки, и его свободная энергия падает. Кривые относятся к разным свободным энергиям f внутренних звеньев - листа. # -точка максимума величины F opt по ходу роста - листа. При росте - листа (в отличие от роста - спирали) максимум его свободной энергии не приходится на самое начало этого процесса. Общий ход изменения минимальной свободной энергии - листа F opt с увеличением числа N звеньев в нем.

При малых -f время образования структуры огромно, в пределе - бесконечно велико. Общий вид зависимости характерного времени образования -листа от стабильности -структуры Так как, согласно теории переходного состояния, время процесса t зависит от свободной энергии переходного (самого нестабильного промежуточного) состояния F # как t ~. exp(+F # /kT), где - время элементарного шага (элонгации -листа на один остаток; скорость элонгации -листа качественно не отличается от скорости элонгации спирали), тогда характерное время образования листа при малых -f есть t ~. exp[A/(-f )], где A - некая константа.

Итак: малостабильная -структура должна образовываться очень медленно, и причина не в медленной элонгации, а в медленной инициации: трудно собрать свободную энергию из теплового движения и преодолеть высокий барьер. Так объясняется и экспериментально наблюдаемая, очень медленная скорость образования -структуры в неагрегирующих полипептидах, и резкий ее рост с повышением стабильности -структуры. В то же время стабильные -листы и шпильки (они и наблюдаются в белках) должны образовываться довольно быстро, примерно как -спираль.

Крайне медленная инициация - общее свойство фазовых переходов первого рода, когда возникающая фаза находится на грани стабильности. Это связано с большой свободной энергией обширной границы раздела фаз. -структура образуется фазовым переходом первого рода со всеми вытекающими последствиями. Наоборот, -спираль не образуется фазовым переходом первого рода: граница спирали, в отличие от границы -структуры (или льдинки), не растет с ее размером. Поэтому барьер, который нужно преодолеть при сворачивании спирали, всегда имеет конечную, небольшую величину, и она может успеть "проинициироваться" за микросекунду.

Вопрос: при каких характерных длинах цепи начинается смешение клубковой и спиральной фаз? Рассмотрим цепь из N звеньев при температуре "середины перехода", где спираль и клубок имеют равную свободную энергию: f EL = 0. Свободная энергия инициации спирали - f INIT. Число возможных положений спирали в цепи из N звеньев порядка N 2 /2 (спираль может начинаться и кончаться в любом месте, ее длина не менее трех остатков). Ни расположение спирали в цепи, ни ее длина при f EL =0 не влияют на свободную энергию спирали.

Смешение клубковой и спиральной фаз начинается в фрагментах длины N ~ n 0, и величина n 0 получается из уравнения f INIT - 2kТ. ln(n 0 ) = 0 Полная свободная энергия внедрения фрагмента новой фазы - спирали - в цепь длины N : f INIT - 2kТ. ln(N). и характерная длина кусков спирали и клубка в середине перехода n 0 = exp(+f INIT /2kТ) = - 1/2