Кафедра медицинской биологии, микробиологии, вирусологии и иммунологии ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ Лектор ст. преп. Малярчук А.Р.

F. Crick i J. Watson

ДНК E. coli

Транспозон и IS элемент

1. Координирующая. 1. Координирующая. 2. Регуляторная 2. Регуляторная 3. Индуцируют мутации по типу делеции или инверсии 3. Индуцируют мутации по типу делеции или инверсии Функции IS-элементов

1. Регуляторная. 1. Регуляторная. 2. Кодирующая. 2. Кодирующая. 3. Индуцируют муктации. 3. Индуцируют муктации. 4. Вызывают хромосомные аберрации. 4. Вызывают хромосомные аберрации. Функции транспозонов

Виды плазмид 1. Трансмиссивные (конъюгация). 1. Трансмиссивные (конъюгация). 2. Нетрансмиссивные (трансдукция) 2. Нетрансмиссивные (трансдукция) 3. Криптические. 3. Криптические. 4. Монокопийные 4. Монокопийные 5.Мультикопийные 5.Мультикопийные

Види плазмід 1. Регуляторная 1. Регуляторная 2. Кодирующая. 2. Кодирующая. Функции плазмид

Функциональные свойства плазмид

Види плазмід - Сol – продукция колицинов - Сol – продукция колицинов - HLy – продукция гемолизинов - HLy – продукция гемолизинов - Tol – расщепление толлуола, ксилола - Tol – расщепление толлуола, ксилола - Ent – продукция энтеротоксина - Ent – продукция энтеротоксина - Nif – связывание азота у K. pneumoniae - Nif – связывание азота у K. pneumoniae - Ti – образование опухолей у растений - Ti – образование опухолей у растений - Плазмиды деградации: - Плазмиды деградации: - Саm – расщепление камфоры - Саm – расщепление камфоры - Oct - расщепление октана - Oct - расщепление октана - Sal - расщепление салицина - Sal - расщепление салицина Виды плазмид

Види плазмид 1. За происхождением: спонтанные и индуцированные 1. За происхождением: спонтанные и индуцированные 2. За локализацией: нуклеоидные и цитоплазматические 2. За локализацией: нуклеоидные и цитоплазматические 3. За количеством генов, что мутировали: генные и хромосомные 3. За количеством генов, что мутировали: генные и хромосомные 4. За величиной: большие (хромосомные) и малые (точковые) 4. За величиной: большие (хромосомные) и малые (точковые) Мутации

Види плазмід 1. Хромосомные: 1. Хромосомные: - инверсия - инверсия - дупликация - дупликация - делеция - делеция - дислокация - дислокация Мутации

Види плазмід 1. Точковые: 1. Точковые: - делеция - делеция -инсерция (вставка) -инсерция (вставка) - замена: - замена: - транзиция (пуриновая основа на пуриновую, пиримидиновая – на пиримидиновую) - транзиция (пуриновая основа на пуриновую, пиримидиновая – на пиримидиновую) - трансверзия (пуриновая основа на пиримидиновую и наоборот) - трансверзия (пуриновая основа на пиримидиновую и наоборот) Мутации

Мутагенные факторы Физические: Физические: 1. УФО (λ-2600 А) – более сильное мутагенное действие; образуются димеры тымину, смена основ 1. УФО (λ-2600 А) – более сильное мутагенное действие; образуются димеры тымину, смена основ 2. Ионизирующее излучение (рентгеновское, гамма-лучи) 2. Ионизирующее излучение (рентгеновское, гамма-лучи)

Мутагенные факторы Химические: Химические: 1. Азотистая кислота (самый доступный и безопасный) 1. Азотистая кислота (самый доступный и безопасный) 2. N-нитрозометилмочевина – супермутаген, канцероген 2. N-нитрозометилмочевина – супермутаген, канцероген 3. Этилметансульфонат 3. Этилметансульфонат 4. Акридины 4. Акридины 5. Нитрозогуанидин 5. Нитрозогуанидин 6. Аналоги основ (5-бромурацил, 2-амінопурин) 6. Аналоги основ (5-бромурацил, 2-амінопурин) 7. Лекарственные препараты (нитрофураны, некоторые антибиотики 7. Лекарственные препараты (нитрофураны, некоторые антибиотики Биологические: перекись водорода Биологические: перекись водорода

Действие разных мутагенов на бактерии Индуктируемые мутации возникают под воздействием действия на клетку установленных мутагенных факторов. Частота их на несколько порядков выше, чем спонтанных. За локализацией мутации подіяють на нуклеоидные, которые возникают в нуклеоиде клетки, и цитоплазматическиеі, которые возникают в позахромосомных элементах наследственности - плазмидах; за количеством генов, которые мутировали, - на генные и хромосомные, за величиной - на большие (хромосомные) и малые (точечные). Хромосомные мутации чаще бывают инверсиями (фрагмент ДНК в молекуле переворачивается на 180°), дупликациями (удвоение участка хромосомы), делециями (выпадение части хромосомы), дислокациями (происходит изменение локализации участка ДНК). Точечные мутации чаще наблюдаются как делеция, вставка фрагменту ДНК (инсерция) или замена основ. Если наблюдают замену пуриновых основ на пуриновую, а пиримидиновых на пиримидиновые, такую мутацию называют транзицией. При условии замены пуриновой основы на пирииідиновую и наоборот, мутация называется трансверсией. Индуктируемые мутации возникают под воздействием действия на клетку установленных мутагенных факторов. Частота их на несколько порядков выше, чем спонтанных. За локализацией мутации подіяють на нуклеоидные, которые возникают в нуклеоиде клетки, и цитоплазматическиеі, которые возникают в позахромосомных элементах наследственности - плазмидах; за количеством генов, которые мутировали, - на генные и хромосомные, за величиной - на большие (хромосомные) и малые (точечные). Хромосомные мутации чаще бывают инверсиями (фрагмент ДНК в молекуле переворачивается на 180°), дупликациями (удвоение участка хромосомы), делециями (выпадение части хромосомы), дислокациями (происходит изменение локализации участка ДНК). Точечные мутации чаще наблюдаются как делеция, вставка фрагменту ДНК (инсерция) или замена основ. Если наблюдают замену пуриновых основ на пуриновую, а пиримидиновых на пиримидиновые, такую мутацию называют транзицией. При условии замены пуриновой основы на пирииідиновую и наоборот, мутация называется трансверсией.

R и S формы колоний Свойства микробов S-колоний Свойства микробов S-колоний Клетки нормальной морфологии Клетки нормальной морфологии Диффузное помутнение бульйона Диффузное помутнение бульйона У подвижных видов есть жгутики У подвижных видов есть жгутики У капсульных вариантов есть капсулы У капсульных вариантов есть капсулы Биохимически более активные Биохимически более активные Полноценные в антигенном отношении Полноценные в антигенном отношении У патогенных видов – вирулентные У патогенных видов – вирулентные Выделяются в остром периоде болезни Выделяются в остром периоде болезни Чувствительные к бактериофагам Чувствительные к бактериофагам Менее чувствительные к фагоцитозу Менее чувствительные к фагоцитозу

Метод реплик

Световая репарация

Темновая репарация

Генетические рекомбинации Рекомбинации - особенные феномены наследственной изменчивости микроорганизмов, которые не связаны с мутационным процессом. Рекомбинанти, что при этом возникают, наследуют некоторые признаки обеих родительских клеток, ведь происходит экспрессия гена реципиента и части генома донора. Генетические рекомбинации создают неисчерпаемый источник многообразных комбинаций генов, которые природа использует в процессе эволюции. Считается, что способность клеток к рекомбинациям детерминируется особенными rec-генами (recombination - рекомбинация). Выделяют три основных вида генетических рекомбинаций: трансформация, трансдукція и конъюгация. Трансформация - процесс гибридизации в результате переноса генетических детерминант от бактерии потому что бактерии с помощью изолированной ДНК. Рекомбинации - особенные феномены наследственной изменчивости микроорганизмов, которые не связаны с мутационным процессом. Рекомбинанти, что при этом возникают, наследуют некоторые признаки обеих родительских клеток, ведь происходит экспрессия гена реципиента и части генома донора. Генетические рекомбинации создают неисчерпаемый источник многообразных комбинаций генов, которые природа использует в процессе эволюции. Считается, что способность клеток к рекомбинациям детерминируется особенными rec-генами (recombination - рекомбинация). Выделяют три основных вида генетических рекомбинаций: трансформация, трансдукція и конъюгация. Трансформация - процесс гибридизации в результате переноса генетических детерминант от бактерии потому что бактерии с помощью изолированной ДНК.

ОПЫТ ГРИФФИТСА Впервые на явление трансформации обратил внимание Ф. Гриффитс в 1928 г., изучая пневмококки (Streptococcus pneumoniae), которые образуют капсулу в организме, а на агаре растут в виде гладких (S-форма) и блестящих колоний. При введении белым мышам убитых нагреванием вирулентных капсульных пневмококков ІІІ типа вместе с авирулентными бескапсульными пневмококками ІІ типа (R-форма) лабораторное животное через несколько дней погибало, а из ее крови высевались живые капсульные пневмококки ІІ серотипу. Следовательно, происходила глубокая перестройка генетического аппарата клетки, которая приобретала способность синтезировать капсулу. Впервые на явление трансформации обратил внимание Ф. Гриффитс в 1928 г., изучая пневмококки (Streptococcus pneumoniae), которые образуют капсулу в организме, а на агаре растут в виде гладких (S-форма) и блестящих колоний. При введении белым мышам убитых нагреванием вирулентных капсульных пневмококков ІІІ типа вместе с авирулентными бескапсульными пневмококками ІІ типа (R-форма) лабораторное животное через несколько дней погибало, а из ее крови высевались живые капсульные пневмококки ІІ серотипу. Следовательно, происходила глубокая перестройка генетического аппарата клетки, которая приобретала способность синтезировать капсулу.

ТРАНСФОРМАЦИЯ В 1944 г. О. Евери, К. Маклеод и М. Маккарти смоделировали этот феномен in vitro, выделили и очистили трансформирующий агент. Им оказалась молекула ДНК. Трансформация происходит только в тех клетках, которые способны к ней. Такое состояние определяется понятием компетентности, природа которой окончательно не выяснена. Считается, что она предопределяется наличием особенного белка - компонента клеточной мембраны, способного расщеплять некоторые структурные элементы клеточной поверхности. Таким образом высвобождаются рецепторные участки, с которыми взаимодействует ДНК. Состояние компетентности формируется на определенных стадиях развития бактериальной клетки. В 1944 г. О. Евери, К. Маклеод и М. Маккарти смоделировали этот феномен in vitro, выделили и очистили трансформирующий агент. Им оказалась молекула ДНК. Трансформация происходит только в тех клетках, которые способны к ней. Такое состояние определяется понятием компетентности, природа которой окончательно не выяснена. Считается, что она предопределяется наличием особенного белка - компонента клеточной мембраны, способного расщеплять некоторые структурные элементы клеточной поверхности. Таким образом высвобождаются рецепторные участки, с которыми взаимодействует ДНК. Состояние компетентности формируется на определенных стадиях развития бактериальной клетки.

МЕХАНИЗМ ТРАНСФОРМАЦИИ Механизм явления трансформации заключается в том, что сначала на поверхности реципиента клетки адсорбируется небольшой фрагмент двониткової ДНК (1/250-1/500 часть хромосомы донора клетки). Впоследствии он проникает внутрь клетки, где одна нить ДНК переваривается эндонуклеазами, а другая - монтируется в клеточную хромосому. Наступает последняя фаза процесса - экспрессия рекомбинантов. Такой процесс интеграции происходит очень быстро. Исследовано, что для появления рекомбинантов достаточно пяти- десятиминутного контакта реципиента клетки с донорской ДНК, а сам процесс завершается через 2 часа. Механизм явления трансформации заключается в том, что сначала на поверхности реципиента клетки адсорбируется небольшой фрагмент двониткової ДНК (1/250-1/500 часть хромосомы донора клетки). Впоследствии он проникает внутрь клетки, где одна нить ДНК переваривается эндонуклеазами, а другая - монтируется в клеточную хромосому. Наступает последняя фаза процесса - экспрессия рекомбинантов. Такой процесс интеграции происходит очень быстро. Исследовано, что для появления рекомбинантов достаточно пяти- десятиминутного контакта реципиента клетки с донорской ДНК, а сам процесс завершается через 2 часа.

ТРАНСДУКЦИЯ –Вызывают умеренные, дефектные фаги –Виды: –- общая (генерализованая) –- специфичная –- абортивная

ТРАНСДУКЦИЯ В 1952 г. Н. Циндер и Д. Ледерберг, изучая процесс конъюгации между разными штаммами сальмонел, обратили внимание, что иногда обмен генетическим материалом происходит не в результате конъюгации, а в результате высвобождения из родительских штаммов умеренного бактериофага. Явление обмена генетической информацией у бактерий путем переноса фагами фрагментов ДНК от донора клетки к реципиенту клетки получило название трансдукції. Она часто происходит в энтеробактерий, псевдомонадах, стафилококках и бациллах. Считают, что большинство видов микроорганизмов несут в своем геноме профаг, потому трансдукция может быть чрезвычайно распространенным явлением в микробном мире. В 1952 г. Н. Циндер и Д. Ледерберг, изучая процесс конъюгации между разными штаммами сальмонел, обратили внимание, что иногда обмен генетическим материалом происходит не в результате конъюгации, а в результате высвобождения из родительских штаммов умеренного бактериофага. Явление обмена генетической информацией у бактерий путем переноса фагами фрагментов ДНК от донора клетки к реципиенту клетки получило название трансдукції. Она часто происходит в энтеробактерий, псевдомонадах, стафилококках и бациллах. Считают, что большинство видов микроорганизмов несут в своем геноме профаг, потому трансдукция может быть чрезвычайно распространенным явлением в микробном мире.

КОНЪЮГАЦИЯ

КОНЪЮГАЦИЯ Впервые это явление исследовали Д. Ледерберг и E. Тейтум на модели кишечной палочки (1946). Необходимым условием для процесса конъюгации является наличие в клетке-доноре особенного фактора, который называется F- фактор (fertility - плодовитость). Он есть конюгативною плазмідою, что существует автономно в цитоплазме бактерии. Складывается она из генов переноса и генов, которые кодируют определенные признаки клетки. Бактерии с F- факторами отражаются как F+-, а без него - F-- клетки. F-фактор детерминирует образование половых ворсинок, следовательно, способность клеток к конъюгации. Половые ворсинки - особенные трубчатые вирости на поверхности клетки. Они полые, длина их в несколько раз превышает величину бактерии. Процесс конъюгации начинается с того, что с помощью половых ворсинок донор клетки касается реципиента клетки, фиксирует ее и притягивает к себе. После этого плазмида начинает реплицироватся, и одна ее нить передается в реципиентный штамм, а другая остается на городе. Впервые это явление исследовали Д. Ледерберг и E. Тейтум на модели кишечной палочки (1946). Необходимым условием для процесса конъюгации является наличие в клетке-доноре особенного фактора, который называется F- фактор (fertility - плодовитость). Он есть конюгативною плазмідою, что существует автономно в цитоплазме бактерии. Складывается она из генов переноса и генов, которые кодируют определенные признаки клетки. Бактерии с F- факторами отражаются как F+-, а без него - F-- клетки. F-фактор детерминирует образование половых ворсинок, следовательно, способность клеток к конъюгации. Половые ворсинки - особенные трубчатые вирости на поверхности клетки. Они полые, длина их в несколько раз превышает величину бактерии. Процесс конъюгации начинается с того, что с помощью половых ворсинок донор клетки касается реципиента клетки, фиксирует ее и притягивает к себе. После этого плазмида начинает реплицироватся, и одна ее нить передается в реципиентный штамм, а другая остается на городе.

Хромосомная карта E. coli

БИОТЕХНОЛОГИЯ Генетические феномены нашли широкое практическое применение в разных отраслях науки, техники, медицины, фармацевтической промышленности, биотехнологии, сельского хозяйства. Благодаря применению генетических методов, получены высокоактивные штаммы бактерий, грибов, актиномицетов, дрожжей, которые продуцировали в раз и больше аминокислот, органических кислот, ферментов, витаминов, кормового белка, сравнительно с выходными, а также вакцинные штаммы микроорганизмов и вирусов. Использование многообразных мутагенов (ультрафиолетовое и радиоактивное облучение, химические вещества) позволило создать мутантний штамм гриба Penicillium chryzogenum, который в диком состоянии продуцировал 100 од/мл пеницилина, а после направленной селекции од/мл. Установлено, что некоторые микроорганизмы, например, Fuzarium monilifore, синтезируют биологически активные субстанции типа фитогормонов, гиберелинов, биоинсектицидов и других, Генетические феномены нашли широкое практическое применение в разных отраслях науки, техники, медицины, фармацевтической промышленности, биотехнологии, сельского хозяйства. Благодаря применению генетических методов, получены высокоактивные штаммы бактерий, грибов, актиномицетов, дрожжей, которые продуцировали в раз и больше аминокислот, органических кислот, ферментов, витаминов, кормового белка, сравнительно с выходными, а также вакцинные штаммы микроорганизмов и вирусов. Использование многообразных мутагенов (ультрафиолетовое и радиоактивное облучение, химические вещества) позволило создать мутантний штамм гриба Penicillium chryzogenum, который в диком состоянии продуцировал 100 од/мл пеницилина, а после направленной селекции од/мл. Установлено, что некоторые микроорганизмы, например, Fuzarium monilifore, синтезируют биологически активные субстанции типа фитогормонов, гиберелинов, биоинсектицидов и других,

Некоторые гормоны человека, продуцируемые рекомбинантнимы микроорганизмами Белок Назва вещества Инсулин Гумулин, Новолин Соматостатин Протропин, Гуматроп Интерферон альфа Роферон, Велферон Интерферон гамма Актимун Интерферон бета Фрон, Бетасерон Интерлейкин-2Пролейкин Фактор некроза опухолей - Эритропоетин Прокрит, Эпоген Гранулоцит колоние- стимулюющий фактор Филграстин, Ньюпоген Плазминоген активатор Актилиз

БИОТЕХНОЛОГИЯ Медицинская наука стоит на пороге разработки методов генной хирургии. Например, у человека порой встречается врожденная недостаточность фермента гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (ГГФРТ). В таком случае она склонна к подагре, часто наблюдается боль в суставах, развивается мочекамяная болезнь. Эксперименты на животных убедительно довели, если вмонтировать ген, ответственный за синтез этого фермента, в ретровирус и ввести его в спинной мозг белых мышей, они начинают синтезировать ГГФРТ. Клонирован из макрофагов человека ген фактора некроза опухолей в кишечной палочке при введении ее белым мышам с саркомами вызывает их разрушение. Широкие перспективы открывает генная инженерия на пути создания высокоэффективных средств специфической профилактики инфекционных заболеваний. Введение в геном кишечных палочек, вирусов вісповакцини, дрожжей некоторых генов вирусов гепатита В, ящур позволили разработать субодинические вакцины. Медицинская наука стоит на пороге разработки методов генной хирургии. Например, у человека порой встречается врожденная недостаточность фермента гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (ГГФРТ). В таком случае она склонна к подагре, часто наблюдается боль в суставах, развивается мочекамяная болезнь. Эксперименты на животных убедительно довели, если вмонтировать ген, ответственный за синтез этого фермента, в ретровирус и ввести его в спинной мозг белых мышей, они начинают синтезировать ГГФРТ. Клонирован из макрофагов человека ген фактора некроза опухолей в кишечной палочке при введении ее белым мышам с саркомами вызывает их разрушение. Широкие перспективы открывает генная инженерия на пути создания высокоэффективных средств специфической профилактики инфекционных заболеваний. Введение в геном кишечных палочек, вирусов вісповакцини, дрожжей некоторых генов вирусов гепатита В, ящур позволили разработать субодинические вакцины.