Федеральное государственное бюджетное учреждение "Медико-генетический научный центр" Российской академии медицинских наук Танас Александр Сергеевич АНАЛИЗ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ ГЕНОМОВ МЕТОДАМИ НЕПРЕДВЗЯТОГО СКРИНИНГА «генетика» «математическая биология, биоинформатика» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель к.б.н. В.В. Стрельников

Скрининг – предвзятый и непредвзятый Скрининг дифференциального метилирования ДНК – систематическое выявление локусов генома, отличающихся характером метилирования в различных типах клеток. Непредвзятый скрининг (hypothesis free) планируется в отсутствие любых предварительных гипотез. Предвзятый скрининг (hypothesis driven) основывается на предварительном теоретическом отборе спектра анализируемых участков, после чего дифференциальный характер их метилирования подтверждается либо отвергается. Основная гипотеза: дифференциальное метилирование характерно для участков промоторных CpG-островков в области +/-200 (до 500) п.н. от сайта инициации транскрипции. 2

Преимущества непредвзятого скрининга расширяет фундаментальные представления о характере и роли метилирования различных структурно- функциональных элементов генома в норме и при патологии способствует диверсификации основ разработки эпигенетических диагностических маркеров 3

Ограничены использованием клонирования и секвенирования для геномного картирования выявленных дифференциально метилированных локусов. секвенирование генома человека математическое моделирование альтернативный способ картирования Возможности применения непредвзятого скрининга 4

Цель исследования Разработать подходы к анализу дифференциального метилирования геномов методами непредвзятого скрининга. 5

Задачи исследования 1.Разработать современный алгоритм непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов. 2.Разработать способ определения геномной принадлежности выявляемых дифференциально метилированных фрагментов ДНК, исключающий необходимость их реамплификации, клонирования и секвенирования. 3.Разработать алгоритм и компьютерную программу моделирования результатов экспериментов с использованием баз данных нуклеотидных последовательностей. 4.Охарактеризовать иерархию продуктов АИМС и описать количественные и качественные параметры продуктов АИМС, получаемых при различных экпериментальных условиях. 5.Провести сравнительный анализ геномов клеточных линий рака молочной железы на основе разработанного алгоритма скрининга дифференциального метилирования. 6

Обобщенная схема метода скрининга дифференциального метилирования геномов Формирование выборки участков генома ферментативный гидролиз аффинное обогащение Сокращение выборки редкощепящие рестриктазы удлинители универсальных праймеров Разделение элементов выборки электрофорез разведение Сравнение профилей вычитательная гибридизация сравнение визуализированных репрезентаций Картирование клонирование и секвенирование по положению на матрице Метод непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов 7

Требования к оптимальному методу скрининга непредвзятый характер скрининга возможность стандартизации (моделирования) простота и экономичность метода высокая производительность быстрое и несложное картирование АИМС (амплификация интерметилированных сайтов) 8

C GGGCC CCGGG C GGG CCC CCC GGG CCC GGG GGG CCC CCGGG C C GGGCC SmaI XmaI C GGGCС C GGGCC C GGGCC C GGGCС 9

Модификации этапов АИМС Капиллярный электрофорез флуоресцентно меченых продуктов Компьютерные инструменты анализа и сравнения электрофореграмм Картирование на основе шаблона выборки Выбор рестриктаз по результатам компьютерного моделирования Выбор удлинителей по результатам компьютерного моделирования 10

AIMS in silico 11

Определение геномной принадлежности C2CD2-5-CpG Межгенный13q32.1-CpG PHF-5-CpG 12

Планирование сокращения выборки Уменьшение количества продуктов АИМС в 5 раз для С,G в 3 раза для A,T (Frigola et al., 2002) 13

Состав геномной выборки CCG-АИМС CpG островки: 66 другие C,G богатые участки: 5 промоторные НЕ CpG-островки; 2 3'-CpG- островки; 6 5'-CpG островки; 33 межгенные CpG-островки; 12 внутригенные CpG-островки; 15 не CpG-островки; 3 14

Анализ геномов клеточных линий РМЖ 15

Картирование выявленных дифференциально метилированных локусов ccg164ccg165ccg168ccg176ccg177.1ccg177.2ccg189 Acc16I+ SbfI + EgeI + + AvrII + Bso31I + GsaI ++ 16

ZR-75-1 MCF7 Карты метилирования ccg177.2 межгенный CpG-островок 13q

Карты метилирования ccg189 C2CD2 (1 экзон) MCF7 18

ccg164ccg165ccg168ccg176ccg177.1ccg177.2ccg189 PURBATMINANK3 MAFK C2CD2 ZR АИМС МСС HBL АИМС МСС HS 578 T АИМС МСС BT АИМС МСС MCF АИМС МСС T-47D АИМС МСС карта +++ Результаты валидации 19

Результаты валидации HBL-100 ccg168 ANK3 T-47D 20

MS-SSCA ccg168 ANK

Геномная локализация дифференциально метилированных участков Фрагментccg189ccg164ccg165ccg177.1ccg168ccg177.2ccg176 Локали- зация 21q22.37p1316q23.27p22.310q21.213q32.112q13.13 ГенC2CD2PURBATMINMAFKANK3межгенный 16кБ 3 ABCC4 межгенный40кБ SCN8A, ANKRD33 1 экзон (5UTR) 1 экзон1 экзон - 1 интрон 1 интрон Нить TSS* CpG-островок CG-кластер

1.Сочетание классического генноинженерного подхода (амплификации интерметилированных сайтов – АИМС) и высокоразрешающего способа разделения фрагментов нуклеиновых кислот - капиллярного электрофореза с математическим моделированием экспериментов позволило разработать современный алгоритм скрининга дифференциального метилирования геномов. 2.Рестриктазное картирование, проводимое на основе предварительного математического моделирования, исключает необходимость реамплификации, клонирования и секвенирования индивидуальных продуктов АИМС в процессе определения их геномной принадлежности. 3.Разработанные алгоритм и компьютерная программа AIMS in silico впервые обеспечили возможность моделирования результатов экспериментов АИМС с использованием баз данных нуклеотидных последовательностей генома человека. Выводы 23

Выводы 4.Проведенная характеристика иерархии продуктов АИМС и полученные описания количественных и качественных параметров репрезентаций АИМС для различных экспериментальных условий позволяют быстро и эффективно осуществлять планирование экспериментов АИМС. 5.Анализ геномов клеточных линий рака молочной железы ZR 75 1, HBL 100, HS 578 T, BT 474, MCF7 и T 47D выявил 6 дифференциально метилированных геномных локусов, которые ранее не изучались с точки зрения дифференциального метилирования. Среди них - участки CpG-островков, расположенных в первых интронах генов ANK3 и MAFK, в промоторной области гена C2CD2, в межгенных областях на хромосомах 12q13.13 и 13q32.1, а также участок первого экзона гена PURB, не являющийся CpG-островком. Выявление дифференциального метилирования неканонической локализации подтверждает непредвзятость разработанного алгоритма скрининга. 24

Спасибо за внимание

Метилирование неканонической локализации Опухолеспецифическое генлокализацияматериалассоциацияметод PAX65 экзонКРР, РМПэктопическаяМЧФП PDX13 экзонКРРэктопическаяРОГС OTX13 экзонэктопическаяРОГС CDKN2A/p163 экзонРПповышенаРОГС CDKN2A/p162 экзонРП CDKN2A/p161 экзонB-ОЛЛ, НМРЛ RASSF11 экзонРМЖ BIN11 интронРМЖ, РПЖснижена Тканеспецифическое генлокализацияфункция PTPRC5 экзональтернативный сплайсинг CUX13 экзональтернативный сплайсинг 26

ccg164ccg165ccg168ccg176ccg177.1ccg177.2ccg189 PURBATMINANK3 MAFK C2CD2 MCF АИМС н/д 0%0% 3%н/д 8%/124%88%н/д 16%RRBS T-47D АИМС н/д 3%3% 8%8% 6%7%9%/11н/д 3%RRBS Сравнение результатов с БД 27

Оценка точности программы Модель: соматических мутаций п.н. в продуктах АИМС 1300 п.н в сайтах SmaI и удлинителя случайное равномерное распределение мутаций геном 3.3*10 9 п.н. анализ образца без метилчувствительной рестрикции Ложноотрицательные: разрушение сайта SmaI + удлинитель (9 нукл.)1,5% создание сайта SmaI внутри продукта0,05% Ложноположительные: создание сайта SmaI + удлинитель (9 нукл.) из последовательностей, отличающихся на 1 нуклеотид на расстоянии не более 1000 п.н.

Потенциал трехнуклеотидных удлинителей 29

Создание репрезентации Сравнение: вычитательная гибридизация Разделение: разведение, клониро-вание Редукция (естественная) Определение геномной принадлежности: секвенирование МЧ-РДА Создание репрезентации Разделение: электрофорез СравнениеРедукция: редкощепящая рестриктаза Определение геномной принадлежности: секвенирование МЧ-РОГС Создание репрезентации Разделение: разведение СравнениеРедукция: (естественная) Определение геномной принадлежности * * * Порядок этапов Methyl-Seq 30

Карты метилирования ccg168 ANK3 (1 интрон) HBL

Скрининг дифференциального метилирования 32

Патентная активность Медицинская ДНК-технология Скрининг аномального метилирования ДНК на основе метода амплификации интерметилированных сайтов для диагностики злокачественного опухолевого процесса Компьютерная программа от AIMS in silico Компьютерная программа от PeakPick 33

Калибровка электрофореграммы по маркеру молекулярной массы 34

Анализ метилирования ДНК из клеток линии Jurkat, культивированных в присутствии 5-Aza-dc 35

Карта метилирования CpG-островка BIN1 promoter CpG island 0,9 kb promoter exon 1 intron 1 36

37

Универсальный праймер с удлинителем 38

Состав геномных выборок АИМС SmaI-GCG, SmaI-CCG 39

Неденатурирующий капиллярный электрофорез 40

Анализ электрофореграмм программой GeneMapper 41

Распределение сайтов узнавания SmaI и HpaII в геноме человека 42