ЛЕКЦИЯ 6 Группа веществ, изолируемых из биологического материала экстракцией и сорбцией. Общая характеристика соединений. Основы метода изолирования. Способы и методы очистки водных извлечений и экстрактов. Подгруппа «Лекарственные вещества». Токсикологическое значение. Особенности метода изолирования. Методы обнаружения и количественного определения. Вещества кислотного характера: 1) Органические кислоты: бензойная, салициловая, ацетилсалициловая, пикриновая. 2) Барбитураты: барбитал, фенобарбитал, барбамил, этаминал-Na, бутобарбитал, гексенал, бензонал, бензобамил, циклобарбитал и др. Вещества нейтрального характера: 1) Небарбитуровые снотворные: ноксирон, тетридин. 2) Сердечные гликозиды. 3) Многоатомные фенолы: гидрохинон, пирогаллол. 4) Полинитропроизводные: м-динитробензол, динитротолуолы, тринитротолуол. 5) Производные анилина и п-аминофенола: фенацетин, п-фенилендиамин. Вещества основного характера: 1) Алкалоиды: производные пиридина и пиперидина (жидкие алкалоиды), тропана (атропин, кокаин и др.), хинолина (хинин), изохинолина (опийные), индола (стрихнин, бруцин, резерпин), пурина (кофеин, теобромин, теофиллин), пирролизидина (платифиллин, саррацин), ациклические (эфедрин), стероидоподобные (вератрин) и неустановленного строения (аконитин). 2) Синтетические вещества основного характера: антипирин, амидопирин - производные пиразола, промедол - производное пиперидина, новокаин и дикаин - производные аминокислот ароматического ряда, изониазид, производные фенотиазина - аминазин и др., производные бензодиазепина и т.д.

Теоретические основы метода изолирования Уравнения степени ионизации (уравнение Гендерсона) α%= для оснований α%= для кислот Изолирование «нелетучих» ядов из биологического материала основано на различной растворимости их ионизированной и молекулярной форм в воде и органических растворителях и на коэффициенте распределения молекулярной формы между водной и органической фазами. Кр =, где К р - коэффициент распределения молекулярной формы, С - концентрации вещества в водной и органической фазах. Чем больше Кр, тем эффективнее идет экстракция.

Факторы, влияющие на эффективность изолирования «нелетучих» ядов из биоматериала На первой стадии: 1)Растворимость яда в используемом экстрагенте рН = рКα + 2(3) для кислот рН = рКα - 2(3) для оснований 2)Экстрагент - Способность легко проникать в клетки тканей. -Высокая растворяющая способность (по отношению к яду). -Селективность (по отношению к анализируемым соединениям). 3)Степень измельченности объекта На второй стадии: 1)Растворимость яда, которая определяется степенью ионизации α и регулируется рН среды. рН = рКα - 2(3) для кислот рН = рКα + 2(3) для оснований 2)Природа экстрагента, его объем, время и кратность экстракции. -Не смешиваются с водой и по плотности ( ) значительно отличаются от нее. -Имеют низкую температуру кипения. -Хорошо растворяют изолируемое вещество и обеспечивают высокий коэффициент распределения его между водной и органической фазами Уравнение степени экстракции (Е) Е = где Кр - коэффициент распределения V H 2 O – объем водной фазы V орг - объем органической фазы

Изолирование подкисленным этанолом Настаивание измельченного объекта с этиловым спиртом, подкисленным щавелевой кислотой до рН 2-3, в течение суток. Упаривание объединенных спиртовых извлечений при температуре 40-50°С до густого остатка, в который по каплям добавляют абсолютный этанол для коагуляции белков. Упаривание фильтрата при той же температуре до густого остатка и разбавление горячей водой для удаления смолистых веществ, жиров и пигментов. Экстрагирование веществ кислого, нейтрального и слабоосновного характера из водного фильтрата хлороформом при рН 2 (трехкратная экстракция), отделение органической фазы и концентрирование полученного извлечения упариванием (фракция А, «кислое» извлечение). Подщелачивание оставшегося после разделения фаз водного слоя до рН 9-10, экстрагирование веществ сильноосновного характера (трехкратная экстракция) хлороформом, отделение органической фазы и концентрирование упариванием (фракция Б, «щелочное» извлечение). Достоинства метода : 1.Метод универсален, т.к. этанол является хорошим растворителем для многих веществ этой группы (как ионизированных, так и молекулярных форм). 2.Метод предусматривает очистку извлечения от балластных веществ. Недостатки метода : 1.Длительность (8-10 рабочих дней) и многостадийность. 2.Потери искомых веществ. 3.Сравнительная дороговизна метода.

Изолирование водой, подкисленной щавелевой кислотой Настаивание измельченного объекта с водой, подкисленной щавелевой кислотой до рН 2-3, в течение двух часов. Экстрагирование веществ кислого, нейтрального и слабоосновного характера из водного фильтрата хлороформом при рН 2 (трехкратная экстракция), отделение органической фазы и концентрирование полученного извлечения упариванием (фракция А, «кислое» извлечение). Подщелачивание оставшегося после разделения фаз водного слоя раствором аммиака до рН 9-10, экстрагирование веществ основного характера трехкратной экстракцией хлороформом, отделение органической фазы и концентрирование упариванием (фракция Б, «щелочное» извлечение). Достоинства метода : 1.Быстрота (анализ можно провести в течение одного рабочего дня). 2.Меньшее количество операций, меньшие потери искомых веществ. 3.Экономичность и дешевизна. Недостаток метода : Образование стойких эмульсий при экстрагировании веществ из водной фазы хлороформом.

Изолирование барбитуратов подщелоченной водой Настаивание измельченного объекта с водой, подщелоченной 20% раствором гидроксида натрия до рН 10 и более, в течение 30 минут. Очистка водного извлечения путем насыщения вольфраматом натрия в кислой среде (H 2 SO 4 ) до рН 2, фильтрование раствора. Экстрагирование эфиром, концентрирование эфирного извлечения упариванием. Достоинство метода : Метод дает достаточно чистые извлечения, т.к. включает стадию очистки (осаждение белков вольфраматом натрия), что повышает качество последующего анализа. Недостаток метода : Соосаждение барбитуратов с белками при обработке вольфраматом натрия.

Частный метод изолирования алкалоидов водой, подкисленной серной кислотой (по В.Ф.Крамаренко) Настаивание измельченного объекта с водой, подкисленной 20% раствором серной кислоты до рН 2-3, в течение двух часов. Очистка водного извлечения от белковых соединений путем насыщения его сульфатом аммония, настаивания в течение часа и фильтрования образовавшегося осадка. Очистка фильтрата от жиров, смол, пигментов путем экстракции эфиром. Эфирное извлечение отбрасывают. Подщелачивание водного извлечения 20% раствором гидроксида натрия и экстрагирование веществ основного характера хлороформом при рН 9-10 (трехкратная экстракция ), отделение органической фазы и концентрирование полученного извлечения упариванием. Достоинства метода : 1.Быстрота 2.Хорошая очистка извлечений от соэкстрактивных веществ Недостаток метода : Потеря искомых веществ из-за соэкстракции на стадии очистки

Исследование биологических жидкостей (кровь, моча, плазма, слюна, сыворотка, промывные воды желудка 1.Жидкость-жидкостная экстракция (ЖЖЭ) Соответствует 2-ой стадии изолирования Недостаток : При прямой ЖЖЭ совместно с ядами из биожидкостей могут экстрагироваться сопутствующие вещества, что заставляет в дальнейшем прибегать к различным методам очистки 2.Сорбция на синтетических смолах, модифицированных силикагелях и активированном угле Достоинства : 1. Метод позволяет не проводить дополнительную обработку пробы и изолирование. 2. Дает возможность одновременно сконцентрировать вещество и провести очистку. Недостаток : При неизвестном яде - опасность его потери из-за недостаточной сорбции и проскакивания через колонку сорбента.

ОЧИСТКА ИЗОЛИРУЕМЫХ ВЕЩЕСТВ ОТ СОПУТСТВУЮЩИХ КОМПОНЕНТОВ БИОМАТЕРИАЛА Соэкстрактивные вещества мешают проведению анализа: 1. Маскируют окраску при проведении реакций окрашивания (обугливание соэкстрактивных веществ под действием концентрированной серной кислоты). 2. Снижают чувствительность микрокристаллических реакций и приводят к образованию кристаллов неправильной формы, либо к их полиморфизму (многообразие форм). 3. Искажают спектры веществ при исследовании в УФ - и ИК-областях. 4. Дают завышенные результаты количественного определения веществ. 5. Многие продукты гнилостного разложения биоматериала дают такие же реакции, как и некоторые ядовитые вещества.

ОЧИСТКА ИЗОЛИРУЕМЫХ ВЕЩЕСТВ ОТ СОПУТСТВУЮЩИХ КОМПОНЕНТОВ БИОМАТЕРИАЛА На 1 этапе изолирования: 1.Удаление механических загрязнений (мелких частиц биоматериала) фильтрованием или центрифугированием. 2. Осаждение примесей при добавлении соответствующих реагентов, например, осаждение белков абсолютным спиртом, ацетоном, трихлоруксусной кислотой, вольфрамовой, фосфорно-вольфрамовой, фосфорно-молибденовой кислотами, насыщение электролитами (Na 2 SO 4, (NN 4 ) 2 SO 4, NaCl). 3. Изменение состава фаз, т.е. введения другого органического растворителя. На 2 этапе изолирования или после него: 1. Реэкстракция, т.е. переведения веществ из одной жидкой фазы в другую при изменении рН раствора. 2. Сублимация - для веществ, способных возгоняться без разложения при нагревании (салициловая кислота, бензойная кислота, барбитураты, жидкие алкалоиды). 3. Хроматография - ионообменная, гель-хроматография, адсорбционная хроматографии на колонках, тонкослойной хроматография.

Аналитический скрининг лекарственных веществ СКРИНИНГ - это научно обоснованная система поиска неизвестного яда, когда в процессе последовательных операций поэтапно отсеиваются (или определяются) отдельные группы веществ или индивидуальные соединения. Требования предъявляемые к скрининговым методам: - - универсальность (возможность подвергнуть исследованию большое количество веществ); - достаточная специфичность (чаще групповая); - - высокая чувствительность (мкг и десятые доли мкг); - - экспрессность (возможность выполнения серийных анализов); - - точность ( 10 %) и воспроизводимость; - - простота и доступность; - - лабильность (возможность оптимизации и модернизации за счет введения новых соединений, материалов, реагентов и оборудования в существующую систему скрининга); - - возможность сочетания с другими методами анализа.

Аналитический скрининг лекарственных веществ Физико-химические методы, применяемые в аналитическом скрининге: - 1. Хроматографические 2. Спектроскопические 3. Иммунохимические Общий скрининг - предусматривает химическое исследование веществ, отличающихся по своему строению и принадлежащих к различным фармакологическим группам. В основном применяется групповая идентификация (например, выделяется группа барбитуратов, производных фенотиазина и др.). Частный скрининг - направлен на исследование веществ внутри группы и идентификацию отдельных ее представителей. Примером - хроматографическое исследование на производные барбитуровой кислоты, позволяющее идентифицировать конкретного представителя в группе барбитуратов.