Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна В.Ю. Нугис Цитогенетические методы оценки неравномерности радиационного воздействия

Определение биологической дозиметрии (по M.L.Mendelsohn, 1991) Оценка величины дозы предшествующего воздействия путём измерения любыми методами (физическими, химическими, биологическими, клиническими) произошедших изменений в биологических объектах или извлечённых из них субстратов

К вопросу о терминах Необходимость развития методов биологической дозиметрии обусловлена тем, что объективно более точная физическая дозиметрия после случайного воздействия радиации часто бывает недоступна, т.к., если и есть физический дозиметр (у профессионалов, у других лиц он отсутствует), то он скорее всего не предназначен для учёта высоких воздействий, расчётный же метод ограничен наличием достоверных сведений о временных и геометрических характеристиках облучения, обычно воспроизводимых со слов пострадавшего. Биологическая дозиметрия это часто применяемый термин, но он некорректен с физической точки зрения. Действительно, доза есть количество энергии, поглощённой единицей массы вещества. Однако величина биологического эффекта зависит не только от дозы. Другие характеристики облучения, например, его вид, энергия, длительность и фракционированность, влияют на величину пострадиационных изменений биологического материала. Также и состояние самого этого биологического материала влияет на пострадиационные эффекты. Поэтому более правильно говорить о биологической индикации дозы.

Цитогенетическая оценка дозы по средней частоте дицентриков в культурах лимфоцитов периферической крови Оценка средней поглощённой дозы на всё тело основана на определении средних частот дицентриков в культурах лимфоци- тов периферической крови. В качестве ка- либровочной кривой применяется линейно- квадратичная зависимость доза-эффект, построенная после гамма-облучения ( 60 Со) крови здоровых доноров in vitro, так как показано, что радиочувствительность хро- мосом лимфоцитов при воздействии радиа- ции in vivo и in vitro примерно одинакова. Каждой лаборатории предлагается иметь свои собственные калибровочные кривые. Это связано с существенной межлабора- торной вариабельностью, наблюдающейся при анализе радиационно-индуцированных хромосомных повреждений в культурах лимфоцитов периферической крови. При этом очень важную роль играют различия в критериях отбора метафаз для анализа и идентификации аберраций хромосом. Такая оценка дозы наиболее эффективна в случаях острого относительно равномер- ного радиационного воздействия.

Прогноз тяжести костномозгового синдрома При обследовании пациентов с ОЛБ оценка полученной дозы важна для выбора тактики лечения на основе определения тяжести заболевания и прогноза течения основных синдромов острого радиационного поражения, к которым относится и костно-мозговой синдром. При обследовании пациентов с ОЛБ оценка полученной дозы важна для выбора тактики лечения на основе определения тяжести заболевания и прогноза течения основных синдромов острого радиационного поражения, к которым относится и костно-мозговой синдром. Ещё в дочернобыльский период были построены дозовые зависимости для пострадиационной динамики числа нейтрофилов, лимфоцитов и тромбоцитов в крови после терапевтического и аварийного гамма-облучения (этим частично обусловлено использование гамма-эффективного эквивалента дозы). На верхнем рисунке представлены такие дозовые кривые для нейтрофилов, на нижнем – для лимфоцитов. Отметим, что картина изменения числа нейтрофилов является интегральным показателем тяжести перенесенного поражения кроветворения, однако в целом она относится к поздним индикаторам дозы, и, собственно говоря, и является объектом предсказания для таких ранних показателей как аберрации хромосом и динамика числа лимфоцитов. Ещё в дочернобыльский период были построены дозовые зависимости для пострадиационной динамики числа нейтрофилов, лимфоцитов и тромбоцитов в крови после терапевтического и аварийного гамма-облучения (этим частично обусловлено использование гамма-эффективного эквивалента дозы). На верхнем рисунке представлены такие дозовые кривые для нейтрофилов, на нижнем – для лимфоцитов. Отметим, что картина изменения числа нейтрофилов является интегральным показателем тяжести перенесенного поражения кроветворения, однако в целом она относится к поздним индикаторам дозы, и, собственно говоря, и является объектом предсказания для таких ранних показателей как аберрации хромосом и динамика числа лимфоцитов.

Прогноз тяжести костномозгового синдрома: ЧАЭС В Таблице приведена группи- ровка 158 пострадавших в зави- симости от цитогенетически оценен- ной дозы. Из Рисунка видно, что у них была обнаружена тесная корре- ляция между оценками доз по цитогенетическим и гематологиче- ским данным, причем длительность пребывания пациентов в зоне облучения не влияла на эту зависи- мость. Также можно заметить и систематическое отклонение дозовых показателей кривых нейтрофилов в данной группе пациентов от полученных ранее зависимостей. Это стало особенно явно, когда на данном материале были получены новые дозовые кривые нейтрофилов. Не ясно, связаны ли эти различия с простым увеличением числа пациен- тов, или с особенностями радиацион- ного воздействия при аварии на Чернобыльской АЭС (фракциониро- вание и пролонгирование). Диапазон средних оценок доз на всё тело, Гр Число пациентов 10,4 – 15,2 6,1 – 10,0 4,0 – 5,8 2,0 – 3,7 1,0 – 1,9 0,2 – 0,8 дицентрики не найдены

Неравномерное облучение: метод Dolphin Y / (1 – e Y ) = X / (N – n 0 ) (1) Y×f = X / N, (2) где f – доля облучённых клеток, Y – частота дицентриков на 1 клетку, N – число сосчитанных клеток, X – число наблюдаемых дицентриков, n 0 – число клеток без дицентриков.

Неравномерное облучение: Qdr-метод Qdr = X / N U = Y DR / [1 exp( Y DR Y Ac )], (3) где X – наблюдаемое число дицентриков + центрических колец, N U – число клеток с нестабильными аберрациями хромосомного типа, Y DR и Y Ac – функции дозовой (D) зависимости частот дицентриков + центрических колец и ацентриков соответственно. Qdr = (с DR +a DR ×D +b DR ×D 2 ) / [1 – exp (-с DR -a DR ×D -b DR ×D 2 -с Ac -a Ac ×D -b Ac ×D 2 )] (D)

Неравномерное облучение: соотношение F =(N d /NP d )×10 4, где F процент облучённых лимфоцитов во всей их популяции, N общее число проанализированных клеток, N d на- блюдаемое число клеток с дицентриками, P d % клеток с дицентри- ками, соответствующий наблюдаемой частоте дицентриков на 1 клетку с дицентриками при равномерном облучении.

Неравномерное облучение: компьютерный метод F(n) = f(D)F[n, Y(D)]dD, (4) где f(D) – искомое распределение лимфоцитов по полученной дозе, F(n) – эмпирическое распределение лимфоцитов по числу содержащихся в них дицентриков, n – частота дицентриков на 1 клетку, F[n, Y(D)] – аналитически заданное распределение Пуассона со средней величиной Y, Y(D) – аналитически заданная калибровочная зависимость от дозы среднего числа дицентриков на 1 клетку, D – доза, Гр. f(D)dD = F[n, Y(D)] = F(n) = 1 (5) f(D)dD = F[n, Y(D)] = F(n) = 1 (5)

Неравномерное облучение: компьютерный метод

Пример предсказания кинетики нейтрофилов крови методом парциальных кривых у пациента с неравномерным облучением (Baranov A.E. et al., 1990): A) парциальные кривые (сплошные линии), соответствующие следующим долям костного мозга, облучённым в дозах: 1.0 Гр – 0.10; 1.5 Гр – 0.15; 2.0 Гр – 0.25; 2.5 Гр ; 5.5 Гр – 0.15 и 9.5 Гр – 0.15 (эта парциальная кривая не показана) и суммарная предсказываемая кривая (пунктир); B) реальная кривая пациента (сплошная линия); суммарная предсказываемая кривая (пунктир); стандартная кривая нейтрофилов для средней поглощённой дозы 3.4 Гр

Неравномерное -облучение: восстановление кривых нейтрофилов с помощью компьютерного метода

Цитогенетическая оценка дозы: неравномерность облучения Дозы непосредственно на гемопоэти- ческую ткань могут быть определены по результатам цитогенетического исследо- вания пунктатов костного мозга, получен- ного из участков, доступных для пункции (грудина, передняя и задняя ости под- вздошных костей справа и слева, остистые отростки грудных позвонков). Для оценки дозы цитогенетический анализ производится в «прямых» (т.е. без культивирования) препаратах хромосом клеток костного мозга, взятого из различных участков. На верхнем рисунке приведена дозовая зависимость в диапазоне 0,5-5 Гр для процента абер- рантных клеток через 24 после облуче- ния. Однако костный мозг является активно пролиферирующей клеточной системой, что приводит к быстрой элими- нации аберрантных клеток. На нижнем рисунке представлен пример изменения их частоты в различные промежутки времени от 1 до 168 ч после локального гамма-облучения в дозе 2,5 Гр.

Цитогенетическая оценка дозы: неравномерность облучения Возникает необходимость учесть элиминацию аберрантных клеток с течением времени и иметь возможность использовать метод анализа прямых препаратов хромо- сом клеток костного мозга для оценки локальных доз в сроки, превышающие 24 ч после облучения. Поэтому была получена единая зависимость доли клеток с аберраци- ями хромосом в костном мозге от величины поглощённой дозы и времени, прошедшего после облучения. Эта зависимость представлена в виде номограммы, позволяю- щей производить оценку доз графически, не прибегая к вычислениям. Ошибка при расчете дозы не должна быть больше 11%. Однако возможность дозовых оценок по данной схеме не превышает 4 суток после воздействия, так как при больших сроках обнаруживаемая частота аберрантных клеток может не отличаться от спонтанных значений. Также имеется дозовое ограничение в связи с тем, что частота аберрантных клеток при анализе через 24 ч после облучения достигает 100% уже при дозе 5 Гр. При больших дозах возможна только экспертная оценка.

Аберрации хроматидного типа в клетках костного мозга

Аберрации хроматидного типа в клетках костного мозга (дозы 4-6 Гр)

Аберрации хроматидного типа в клетках костного мозга (дозы 8-9 Гр)

Аберрации хроматидного типа в клетках костного мозга (дозы больше 8-9 Гр)

НЕРАВНОМЕРНОЕ ОБЛУЧЕНИЕ: КУЛЬТУРЫ ЛИМФОЦИТОВ КОСТНОГО МОЗГА

Цитогенетическая оценка дозы: неравномерность облучения Таким образом, метод подсчёта аберрантных клеток в костном мозге позволяет оценивать дозы, полученные отдельными участками костного мозга, что важно для прогноза тяжести пострадиационного костномозгового синдрома. Однако он имеет существенные дозовые и временные ограничения. Таким образом, метод подсчёта аберрантных клеток в костном мозге позволяет оценивать дозы, полученные отдельными участками костного мозга, что важно для прогноза тяжести пострадиационного костномозгового синдрома. Однако он имеет существенные дозовые и временные ограничения. Анализ аберраций хромосом в лимфоцитах периферической крови менее связан этими параметрами. Он не требует коррекции на время, прошедшее после облучения, примерно в течение 1 месяца и позволяет оценивать дозы, по крайней мере, до 15 Гр гамма-излучения. Однако, даже если не учитывать чисто математические неопределённости метода компьютерного перевода распределений клеток по числу дицентриков в распределения лимфоцитов по дозе, серьёзные ошибки могут возникнуть, если распределение дозы по массе тела будет плохо отражать распределение дозы по красному костному мозгу. Анализ аберраций хромосом в лимфоцитах периферической крови менее связан этими параметрами. Он не требует коррекции на время, прошедшее после облучения, примерно в течение 1 месяца и позволяет оценивать дозы, по крайней мере, до 15 Гр гамма-излучения. Однако, даже если не учитывать чисто математические неопределённости метода компьютерного перевода распределений клеток по числу дицентриков в распределения лимфоцитов по дозе, серьёзные ошибки могут возникнуть, если распределение дозы по массе тела будет плохо отражать распределение дозы по красному костному мозгу. Определённый эффект могло бы дать некое объединение двух методик цитогенетического анализа в виде использования для оценки локальных доз на гемопоэтическую ткань культур лимфоцитов костного мозга, взятого из различных участков. Однако здесь возникает своя трудность, связанная с трудно устранимым разведением костного мозга кровью при его взятии, что приводит к завышению оцениваемой дозы на наименее поражённые участки и её занижению на облучённые в наибольшей дозе участки костного мозга. Это связано с наличием в культуре лимфоцитов как из костного мозга, так и из крови. Определённый эффект могло бы дать некое объединение двух методик цитогенетического анализа в виде использования для оценки локальных доз на гемопоэтическую ткань культур лимфоцитов костного мозга, взятого из различных участков. Однако здесь возникает своя трудность, связанная с трудно устранимым разведением костного мозга кровью при его взятии, что приводит к завышению оцениваемой дозы на наименее поражённые участки и её занижению на облучённые в наибольшей дозе участки костного мозга. Это связано с наличием в культуре лимфоцитов как из костного мозга, так и из крови. Следовательно, имеющиеся преимущества и недостатки всех рассмотренных подходов требуют их совместного использования. Следовательно, имеющиеся преимущества и недостатки всех рассмотренных подходов требуют их совместного использования.